牛奶過敏原檢測方法研究進展

賈　　敏，張亦凡，張銀志，孫秀蘭，，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.陜西省漢中市產品質量監(jiān)督檢驗所，陜西漢中723000；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

牛奶過敏原檢測方法研究進展

賈敏1，張亦凡2，張銀志3，孫秀蘭1，3，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.陜西省漢中市產品質量監(jiān)督檢驗所，陜西漢中723000；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

牛奶是八大食物致敏原之一，能引起嚴重的過敏反應。如何實現(xiàn)食物中牛奶過敏原的快速，準確篩檢已成為食品安全領域關注的焦點。牛奶主要過敏原為酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，其檢測方法有電泳法、色譜法、酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）、傳感器、基于質譜的蛋白質組學（LC-MS/MS）、聚合酶鏈式反應技術（PCR）等。本文就其檢測方法的原理和應用進行綜述，旨在為食品中牛奶過敏原的檢測提供技術方向，以便保障牛奶過敏患者的安全。

牛奶過敏原，檢測，酶聯(lián)免疫實驗，聚合酶鏈式反應技術，基于質譜的蛋白質組學

食物過敏是一個全球關注的公共衛(wèi)生問題，據(jù)統(tǒng)計，全世界約有1%～2%成人和5%～8%兒童對某些食物存在過敏反應［1］。牛奶過敏（CMA）是由于攝入乳或含有乳制品的食物而引起的異常免疫反應，在兒童中（3歲以內）引起廣泛的不良反應，其發(fā)病率高達7.5%［2］。近年來隨著乳及乳制品在人群中的消費量不斷的增加，牛奶過敏率也在逐漸增加，牛奶過敏成為一個不容忽視的食品安全問題。牛奶蛋白含量豐富，理論而言天然牛奶含有的任何一種蛋白質都有潛在致敏性，但目前普遍認為酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（beta-lactoglobulin，β-Lg）及α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-La）是主要的牛奶過敏原［3］。

目前國內外對牛奶過敏性疾病沒有徹底有效的根治方法，防止牛奶過敏的唯一有效手段是避免食入含有乳及乳制品的食物。為保護消費者健康，美國及歐盟新食品標簽法規(guī)定含有牛奶成分的食品必須標示牛奶過敏原成分［4］，我國在各級食品標準中也做了相關的規(guī)定，《GB 7718-2011預包裝食品標簽通則》及《GB/T 23779-2009預包裝食品中的致敏原成分》［5-6］均對食品過敏原標示有明確要求。因此為確保食品標簽的準確性和消費者的安全，實現(xiàn)對食物過敏原的靈敏，可靠檢測至關重要。至今為止，對食物過敏原的檢測主要是基于蛋白和核酸水平的研究。基于蛋白的傳統(tǒng)檢測方法有電泳法、色譜法及酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）及免疫傳感器等，但基于傳統(tǒng)的電泳法、色譜法及免疫學方法往往是針對單個蛋白進行分析，其研究發(fā)展較為成熟但尚不足以滿足實際需要，而近年來基于質譜蛋白質組學的運用，為實現(xiàn)對多種食品過敏原同時進行高通量、高靈敏度的快速檢測提供了新的手段。利用液相色譜和質譜聯(lián)用的方法（LC-MS/MS）可直接對致敏性蛋白進行檢測或將蛋白經專一蛋白酶水解，在肽段水平間接實現(xiàn)過敏性蛋白的檢測。伴隨核酸快速檢測技術研究的發(fā)展，基于DNA的特異性檢測方法被引入食品過敏原成分的檢驗，基于核酸的檢測方法主要有普通PCR、real-time PCR。

1　基于蛋白的傳統(tǒng)牛奶過敏原檢測方法

1.1電泳法

電泳是帶電粒子在電場中泳動的現(xiàn)象。根據(jù)工作原理可分為：毛細管電泳、移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳等［7］。其中毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）在過敏原蛋白的分離檢測上應用較為廣泛。毛細管電泳是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，根據(jù)樣品各組分之間多種特性（電荷、大小、等電點、極性、親和行為、分配特性等）的不同而實現(xiàn)分離目的的一類液相分離技術，具有高效、簡單、經濟、微量、自動化等優(yōu)點［8］。近年來，研究人員針對毛細管電泳在牛奶過敏蛋白的檢測做了深入研究。田蘭［9］選擇聚乙烯醇涂層毛細管，采用檸檬酸緩沖體系（pH3.0），在紫外檢測214nm、分離電壓20kV條件下對乳及乳制品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白進行分離測定。結果顯示五種蛋白的線性良好，相關系數(shù)均大于0.9978，加標回收率范圍為88.1%～110.8%。劉一［10］研究建立了一種簡單、快速、靈敏、重現(xiàn)性好的毛細管區(qū)帶電泳（CZE）方法，利用未涂層的熔融石英毛細管為分離柱，在電壓30kV，pH7.0的磷酸鹽緩沖液，毛細管溫度25℃，紫外檢測波長205nm的條件下，2min內實現(xiàn)了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的基線分離和痕量檢測。通過實驗參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化有效解決了兩種蛋白在毛細管內壁的吸附問題，實現(xiàn)了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的高效分離和高靈敏檢測。兩種蛋白的檢出限分別為3、12mg/L；線性范圍為10～250、40～1000mg/L。

1.2色譜法

高 效 液相 色 譜（highperformanceliquid chromatography，HPLC）是一種基于樣品分子在固相（即柱填料）和流動相（即淋洗液）之間的相互作用而實現(xiàn)分離的一種快速、高效的新型分析技術。因其具有高效、選擇性好、靈敏度高、應用范圍廣等特點，已成為蛋白質物質快速分離和分析的重要手段。食物過敏蛋白的檢測主要為反相高效色譜法（RP-HPLC），RP-HPLC是流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，應用范圍廣泛，普遍適用非極性和弱極性物質的分離。

目前，RP-HPLC分析乳清蛋白在國內外已經進行了一定的研究。朱宏［11］建立了一種快速、簡便、靈敏的RP-HPLC法同時定量檢測乳清蛋白中牛乳鐵蛋、轉基因人乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。采用Proteonavi C4色譜柱（5μm，250μm×46μm），流動相A為0.1%的三氟乙酸-水溶液，B為乙腈水溶液，梯度洗脫：流動相B最初為18%，在15min內從上升到43%，保持5min，10min升至75%，在最后15min內降到18%，流速為0.5mL/min，二極管陣列檢測器，檢測波長280nm，柱溫35℃。結果顯示5種蛋白都可以在優(yōu)化的色譜條件上實現(xiàn)較好的分離，采用外標法定量，線性關系較好，相關系數(shù)均大于0.999。Ferreira［12］采用RP-HPLC法對牛，綿羊，山羊中的β-乳球蛋白進行定量檢測，流動相同樣為三氟乙酸的水溶液和乙腈水溶液。

1.3ELISA

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是以酶作為標記物，以抗原和抗體之間免疫結合反應為基礎的固相吸附測定方法。它是在免疫技術基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術，最早出現(xiàn)在20世紀70年代，具有操作簡單、處理樣品量大、易于標準化等優(yōu)點，現(xiàn)階段已經廣泛應用于食品安全質量的快速篩查，并取得較好的效果。目前，應用于牛奶過敏原的ELISA檢測方式主要有雙抗體夾心ELISA和競爭ELISA兩種。ELISA在牛奶過敏原檢測方面對象有所差異，僅限用于單一致敏蛋白的檢測或總蛋白的檢測。布冠好［13］在制備β-Lg多克隆抗體的基礎上，建立了定量檢測牛乳β-Lg的間接競爭ELISA方法，檢測范圍在0.05～1μg/mL之間，回收率實驗結果顯示基于β-Lg的競爭ELISA具有較好的重現(xiàn)性。酶聯(lián)免疫技術的特異性和靈敏度取決于抗體的特異性和效價，相對而言單克隆抗體的特異性較好，多克隆抗體的靈敏度較高。王碩［14］通過包被鼠抗酪蛋白單克隆抗體，HRP標記兔抗酪蛋白多克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測牛奶過敏原酪蛋白。檢測線性范圍為6～1666ng/mL，相關系數(shù)為0.9949，最低檢測限為7ng/mL，可計算出來牛乳中酪蛋白含量。肖海龍等［15］通過單抗和多抗的組合建立了定性檢測牛奶β-酪蛋白的雙抗夾心ELISA方法，最低檢測限為15ng/mL且與其他蛋白無交叉反應，特異性較好。食品工業(yè)原料比較復雜，因此實際樣品ELISA檢測往往受到食物復雜的生物基質影響。基于此Monaci［16］以餅干為食物模型，研究了焙烤時間和基質效應對ELISA檢測牛奶過敏原的影響。

ELISA技術較為成熟，目前市場上已有多種針對牛奶過敏原定性或定量檢測的商業(yè)試劑盒，如Neogen、R-biopharm、Elisa Systems、WAKO等，可在短時間內實現(xiàn)牛奶過敏原的定性或半定量檢測。WAKO的牛奶過敏原檢測試劑盒，檢測限為0.05μg/mL，最低定量限為0.04μg/mL，回收率在79%～122%之間。NH HAM公司牛奶過敏原檢測試劑盒測定范圍在0.78～50ng/mL，靈敏度達到0.78ng/mL，可在短時間內檢測原材料食品和加工食品中的牛奶過敏原蛋白質。張海英等［17］對市售兩種β-乳球蛋白檢測試劑盒進行了比較，得出兩種試劑盒對β-乳球蛋白檢測的回收率，精密度均可達到ELISA檢測技術要求，R-biopharm試劑盒特異性較高僅可檢測牛奶中β-乳球蛋白含量，Elisa Systems試劑盒針對哺乳動物乳汁（牛、羊等中的β-乳球蛋白），不能特異性識別牛奶中的β-乳球蛋白。張霞［18］對市面上三種酪蛋白檢測試劑盒進行對比實驗，Elisa Systems試劑盒對羊奶酪蛋白檢測結果也為陽性，Neogen和R-biopharm試劑盒均可特異性檢測牛奶酪蛋白成分。

1.4生物免疫傳感器

生物傳感器利用生物活性物質的分子識別功能，將其識別待檢物質所引起的化學或物理變化，借助轉換器變換成電信號，從而實現(xiàn)目的物質的檢測。識別原件可為蛋白、細胞、DNA等生物大分子，其特點是自動化程度高、成本低、準確敏感，能在數(shù)分鐘內出結果，非專業(yè)人員即可使用，無需培訓。目前已經逐漸應用于食品安全分析。免疫傳感器是目前應用最為廣泛，發(fā)展最為成熟的一種生物傳感器。免疫傳感器是以抗原抗體的特異性反應為基礎，通過在電極上固定抗原/抗體，實現(xiàn)對抗體/抗原的檢測。目前已經有技術人員將免疫傳感器應用于牛奶過敏原的檢測：王玲玲［19］在玻碳電極表面修飾石墨烯和殼聚糖的復合物，通過納米金對抗體的親和力將其固定到電極表面制成免疫傳感器。在10～1000μg/L范圍內線性關系良好，檢測限為2μg/L。Eissa［20］在絲網印刷碳電極表面修飾石墨烯有機膜，利用石墨烯表面的氨基團和β-乳球蛋白抗體之間的共價結合將抗體固定到電極表面，利用循環(huán)伏安法（CV）進行免疫傳感器電化學行為表征，差分脈沖伏安法（DPV）進行線性分析。免疫傳感器的線性檢測范圍為1～100pg/mL，檢測限為0.85pg/mL，并能特異區(qū)分卵清蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、溶菌酶。與ELISA檢測結果進行比對，結果顯示ELISA和免疫傳感器檢測結果具有較好的相關性，進一步表明研制的免疫傳感器可用于實際樣品中β-乳球蛋白的檢測。

2　基于蛋白質組學的牛奶過敏原檢測方法

目前廣泛應用于過敏原檢測的方法主要是ELISA，直接檢測致敏性蛋白，只能針對單個蛋白，存在特異性差，線性范圍窄等缺點。在此基礎上依靠質譜技術的蛋白質組學逐漸應用發(fā)展起來，可用于多個蛋白的定性或定量分析，具有高靈敏度、高分辨率、高準確度、高通量等特點［21-22］。

蛋白質組學旨在鑒定出一個細胞組織或器官中全部蛋白組成質量和數(shù)量的信息，質譜作為蛋白質組學研究的一項強有力的工具日趨成熟并發(fā)揮著核心作用［23］。為提高準確性質譜技術常與色譜技術聯(lián)用（LC-MS/MS），將色譜的分離能力和質譜的選擇能力結合起來，減少相似結構性質的蛋白質和多肽的干擾，特異性更高，避免了樣品基質的干擾，可實現(xiàn)對復雜混合物更準確的定性或定量分析。在過敏原蛋白檢測上，質譜聯(lián)用技術已經廣泛用于食品中花生［24］、大豆［25］、牛奶雞蛋［26］過敏原的定性、定量檢測。如何從大規(guī)模質譜數(shù)據(jù)中得出蛋白質表達水平即蛋白質定量信息一直是蛋白質組學關注的熱點。定量蛋白質組學是在整體水平上研究蛋白質的定量分析，是通過比較多個樣品質譜相關信息的豐度變化進行定量［27］。定量蛋白質組學有基于蛋白質本身進行的定量或肽段水平的定量。

2.1蛋白水平的定量分析

蛋白水平的定量分析，被分析物是蛋白本身，在蛋白分子量較小的情況下，蛋白直接經過質譜儀得到蛋白譜圖。由于食物蛋白譜圖并不復雜，因此可以利用外標法進行定量分析。Monaci等［28］利用液相色譜質譜連用法對果汁中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白（A和B）進行定量檢測。利用固相萃取進行果汁樣品前處理，液相色譜采用C5色譜柱，流動相A為5%乙腈水+0.1%甲酸，流動相B為95%乙腈水+0.1%甲酸，梯度洗脫，流速為0.25mL/min，柱溫45℃。質譜系統(tǒng)由配備有大氣壓負離子源的三重四級桿質譜儀組成，采用多離子監(jiān)測方式（MIM）進行定量分析。結果顯示建立的LC-MS（MIM）方法可實現(xiàn)對三種乳清蛋白的同時檢測，線性關系良好，相關系數(shù)大于0.995，檢測范圍為5～40μg/mL，檢測限達到1μg/mL（S/N=3），定量限為4μg/mL（S/N＞10），將建立的方法應用于市售15種混合果汁的乳清蛋白檢測，取得較為滿意的結果。Czerwenka等［29］以山羊和羚羊β-乳球蛋白為內標，采用液質聯(lián)用方法對牛奶中的β-乳球蛋白（A和B）進行了絕對定量。

2.2肽段水平的定量分析

蛋白經專一蛋白酶水解，可在肽段水平上間接實現(xiàn)蛋白的定量。利用蛋白的鑒定技術，對致敏蛋白胰蛋白酶水解后得到的肽混合物進行分析，從分析得到的肽段中選擇即具有特異性，又有良好的穩(wěn)定性和較高靈敏度的特征肽段（標簽肽，Signature peptide）進行蛋白檢測［30］。蛋白質組學在過敏原檢測初期研究主要用于定性檢測。Monaci［31］研究選擇了酪蛋白（αs1、αs2、β、κ）的特異性肽段，以選擇的肽段表征過敏原的存在，并對葡萄酒中的酪蛋白過敏原進行檢測。Weber［32］以液相色譜四級桿飛行時間串聯(lián)質譜（LC-Q-TOF）對αs1酪蛋白酶解后肽段進行分析，選擇了兩個特異性肽段，應用到其他食品酪蛋白過敏原的檢測。Ansariyi［33］對反芻類動物乳汁中四種牛奶過敏蛋白（α-CN，β-CN，α-La，β-Lg）的標簽肽進行分析選擇，實現(xiàn)四種蛋白的同步檢測。

基于肽段的定量蛋白質組學主要分為兩類：同位素標記定量技術和無標記定量技術。基于標記定量可獲得較高的準確度，使用同位素標記合成的定量標簽肽段作為內標物進行蛋白質絕對定量已經得到廣泛應用。其原理是基于標簽肽和同位素標記合成內標肽之間的分子量差異，通過檢測定量標簽肽和內標肽的信號強度比值進行定量分析。雖然同位素標記定量準確度較好，但其成本較高，技術難度較大。目前也有研究發(fā)現(xiàn)無標記定量方法與標記定量方法可達到相似的準確度，無標記定量主要是采用氨基酸序列相似的肽段作為內標。唐等［34］對同位素內標和無同位素標記內標進行了比對實驗，利用LC-MS/ MS的多反應監(jiān)測模式（Mulitple Reaction Monitoring，MRM）對人腫瘤細胞和組織中的NQO1蛋白進行絕對定量，結果表明非同位素內標取得和同位素標記的檢測結果具有很好的相關性，可以作為現(xiàn)今研究較為接受的同位素標記定量方法的補充替換。李盈淳［35］也利用設計合成的肽段作為內標進行細胞內P53蛋白的定量，線性關系良好（R2=0.9993），檢測范圍為2.2～112.3pmol/mL。肽段水平的牛奶過敏蛋白定量檢測已有報道，但尚處于起步階段，研究較少。馮小燕［36］利用LC-MS/MS對牛奶過敏原α-酪蛋白進行檢測，以OVA特征肽段作為內標，在0.5～250mg/L范圍內有較好線性關系，檢測限達到0.5mg/L，從奶粉、餅干、蛋黃派夾心及表面中分別檢測到2092.38、104.91、74.50、14.83μg/g酪蛋白。

3　基于核酸的牛奶過敏原檢測方法

聚合酶鏈式反應技術（PCR）是以DNA/RNA為基礎發(fā)展起來的一項檢測技術，經高溫變性、低溫退火及中溫延伸等三步環(huán)節(jié)組成一個循環(huán)周期，達到目的基因特異性擴增的目的。目前PCR技術已經逐漸取代ELISA技術成為實驗室和檢測機構的主流檢測方法，市面上也逐漸出現(xiàn)商業(yè)化的PCR檢測試劑盒。PCR技術分為普通PCR和實時熒光定量PCR兩種。普通PCR技術主要用于定性檢測，檢測結果需電泳驗證，容易受交叉污染產生假陽性結果。在普通PCR技術基礎上發(fā)展起來的實時熒光PCR通過對擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量分析。與傳統(tǒng)PCR技術相比，它具有特異性強、準確度高、PCR污染少、自動化程度高等優(yōu)點，且無需電泳驗證可實現(xiàn)目的基因的定量分析。關瀟［37］，許慶金［38］分別建立了牛奶α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的定性PCR檢測技術，為實際樣品中的牛奶過敏原DNA的檢測奠定了基礎。目前還沒有實時熒光定量PCR用于牛奶過敏原的檢測報道，但它將是檢測牛奶過敏原的一個具有前瞻性的發(fā)展方向。

與基于蛋白的免疫學方法相比，PCR技術的特異性引物與靶基因專一結合而與其他相似序列無法結合，特異性較高可以克服交叉反應的影響，避免對單一特異性抗體的需求。且DNA較蛋白相對穩(wěn)定，在食品加工過程中蛋白容易受酶、溫度、壓力的影響而導致結構破壞，使得致敏性蛋白容易檢測不出來，DNA比較穩(wěn)定，即使蛋白被破壞也可以提取出來DNA，不會影響檢測結果。因此PCR技術可以作為傳統(tǒng)的基于蛋白的補充方法，對食品中的潛在致敏原進行快速檢測。

4　結語

牛奶可引起嚴重的過敏反應，由于其營養(yǎng)價值豐富在食品中廣泛存在，且在人群消費量中占很大比重，其引起的過敏問題已引起了全世界范圍的關注。因此為維護食品安全和保護消費者健康，迫切需要建立快速、準確、高通量的牛奶過敏原體外檢測方法。目前應用最廣泛的過敏原檢測方法主要是基于蛋白的傳統(tǒng)ELISA方法和基于基因的PCR方法。ELISA方法直接檢測致敏蛋白，是目前應用最為成熟的可實現(xiàn)標準化的檢測方法。但ELISA方法具有較低復雜度的特異性蛋白識別位點，蛋白被食品中復雜的生物基質掩蓋導致實驗結果的不準確。蛋白在加工過程易變性，導致檢測結果的假陰性，且ELISA實驗只針對單一蛋白的檢測。基于核酸的PCR技術相對免疫學方法具有靈敏度高，特異性強等優(yōu)點。但是PCR檢測的是DNA而非致敏性蛋白，檢測的結果不能真正說明食物的致敏性。在此基礎上需要建立一種準確、特異、高通量的檢測過敏原的方法。基于蛋白質組學的LC-MS/MS為這一目標開辟了新的道路。蛋白質組學檢測方法具有高靈敏、高通量、特異性強等優(yōu)點，可同時對食物中的多種過敏蛋白進行同時檢測。可在蛋白水平和肽段水平實現(xiàn)蛋白的定量，且有報道說明若選擇的肽段與致敏原表位重合，可進一步說明食物的致敏性［39］。現(xiàn)在蛋白質組學應用于過敏蛋白的定量尚處于研究階段，還有很多不足需要改進，但定量蛋白質組學在過敏原的檢測方面具有廣闊的應用前景。

雖然已有多種方法應用于牛奶過敏原檢測在一定程度上能夠滿足靈敏度和準確性的要求。但是綜合考慮靈敏度、特異性、準確度、檢測限、樣品量、經濟成本等因素，目前還沒有一種方法能夠滿足多樣化的實際樣品檢測要求，但隨著研究進行，檢測方法也在被不斷的改進，其靈敏度和準確度得到了進一步的提高。并且隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，使得過敏原的檢測向高靈敏度、高準確度、高通量、操作簡單方向發(fā)展，為我國食品過敏原的快速檢測提供技術支撐。

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Research progress of milk allergen detection

JIA Min1，ZHANG Yi-fan2，ZHANG Yin-zhi3，SUN Xiu-lan1，3，*
（1.School of Food Science of Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Hanzhong Products Quality Supervison and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

Milk is recognized as one of the major food allergens，which could cause severe allergic reactions. The rapid and accurate detection of milk allergen have gained tremendous attention in the field of food safety. The major allergens in milk include casein（CN），beta-lactoglobulin（α-Lg）and alpha-lactalbumin（β-La）.The currently available detection method include electrophoresis chromatography，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），biosensor，proteomics based on mass spectrometry（LC-MS/MS）and polymerase chain reaction（PCR）.In this article，the principles and applications of major detection methods for milk allergens were summarized，which will provide guidance for the milk allergen detection in different food sources and the ensure of food safety for human health.

milk allergen；detection；ELISA；PCR；LC-MS/MS

TS252.7

A

1002-0306（2015）12-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.073

2014－09－23

賈敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

孫秀蘭（1976-），女，博士，教授，主要從事食品安全檢測方面的研究。

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAK10B03）。