NA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用與展望

左示敏　周娜娜　陳宗祥　張亞芳　湯義華　毛從亞　許學(xué)宏　許明　許如根　潘學(xué)彪

摘要：DNA指紋檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于植物新品種鑒定已是必然的發(fā)展趨勢(shì)，在水稻上與其相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)仍待完善。本文對(duì)DNA指紋檢測(cè)中主要涉及的分子標(biāo)記及特點(diǎn)進(jìn)行歸納，并綜述了DNA指紋在我國(guó)水稻品種鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題。提出了構(gòu)建國(guó)家和地方兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略，認(rèn)為可將利用高密度SN標(biāo)記構(gòu)建的品種SN指紋制定為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而基于核心SSR標(biāo)記構(gòu)建的品種SSR指紋可制定為地方標(biāo)準(zhǔn)。討論了兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)在品種培育、審定管理、市場(chǎng)監(jiān)管及品種權(quán)保護(hù)過(guò)程中的應(yīng)用策略以及仍需研究的問題，以期為建立規(guī)范化的“水稻品種鑒定 DNA指紋”檢測(cè)方法提供幫助。

關(guān)鍵詞：水稻；品種鑒定；DNA指紋；分子標(biāo)記；標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號(hào)： S5037文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：002-302（204）2-0004-04[HS）][HT9SS]

品種是指人類在一定的生態(tài)條件和經(jīng)濟(jì)條件下，根據(jù)人類的需要所選育的某種作物的一定群體，它具備相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特性，在生物學(xué)、形態(tài)學(xué)及經(jīng)濟(jì)性狀上具有相對(duì)一致性，與同一作物的其他群體在特征、特性上有所區(qū)別即特異性，在產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)等方面都能符合相應(yīng)地區(qū)的生產(chǎn)發(fā)展需要。作物優(yōu)良品種的選育和推廣是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)的重要支撐，是確保我國(guó)糧食安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)植物品種進(jìn)行DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）測(cè)試一直是新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[2-3]。DUS測(cè)試主要以田間種植鑒定為主，即根據(jù)品種間的田間表型差異判定新品種是否有別于其他品種[2-3]。由于DUS測(cè)試周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響、工作量大，加上新品種數(shù)量越來(lái)越多，導(dǎo)致在實(shí)踐中無(wú)法通過(guò)DUS測(cè)試確定新品種是否有別于現(xiàn)有的所有品種，以及在違規(guī)經(jīng)營(yíng)中究竟侵犯了哪個(gè)品種，此外鑒定結(jié)果也嚴(yán)重滯后，影響了執(zhí)法效率[3]。研究表明，DNA分子標(biāo)記可應(yīng)用于品種真實(shí)性鑒定、審定監(jiān)管等各個(gè)環(huán)節(jié)，其具備鑒定效率高、周期短、結(jié)果準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)[4-8]。在水稻上，迄今尚未形成一個(gè)廣適性的品種SSR指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[9-]。本文對(duì)DNA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行分析，提出構(gòu)建國(guó)家和省級(jí)兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的建議及構(gòu)建策略，以期為不同領(lǐng)域的研究和管理人員理解DNA指紋并盡快建立標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用規(guī)程提供幫助。

[WTHZ]水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標(biāo)記

SSR標(biāo)記及其多態(tài)性分析方法

SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，一般是由2～4個(gè)核苷酸為重復(fù)單位（基序，motif）組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，如（AT）n、（GCA）n等，其中n表示重復(fù)次數(shù)，其在同一物種不同基因型品種間的差異較大，并造成SSR長(zhǎng)度多態(tài)性[5，]。SSR位點(diǎn)兩端多是保守的單拷貝序列，因此，可用兩側(cè)的保守序列開發(fā)特異CR引物，并通過(guò)CR和凝膠電泳技術(shù)，顯示SSR位點(diǎn)在品種/個(gè)體間的多態(tài)性。由于生物基因組中存在非常豐富的SSR位點(diǎn)、數(shù)量龐大，理論上分布于整個(gè)基因組的不同位置上，因而，基于SSR位點(diǎn)的分子標(biāo)記可用于鑒別品種的遺傳多樣性。隨著水稻基因組序列的測(cè)序完成，水稻基因組中被發(fā)現(xiàn)存在超過(guò)8 000個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每25 kb就存在個(gè)SSR位點(diǎn)[2-3]，這為利用SSR標(biāo)記研究水稻品種間的遺傳多樣性以及品種真?zhèn)涡蕴峁┝素S富的標(biāo)記基礎(chǔ)。

SSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、效率高、重演性強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位和標(biāo)記輔助育種等眾多領(lǐng)域，也是當(dāng)前主要農(nóng)作物品種（如玉米、水稻、大豆）真?zhèn)涡澡b定中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[，4-7]。SSR標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)可采用瓊脂糖凝膠電泳、（變性或非變性）聚丙烯胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法進(jìn)行[5，7-20]，各方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表。比較而言，毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)方法的分辨率最高[9-20]，理論上可達(dá)到 bp，盡管當(dāng)前的儀器設(shè)備和試劑成本較高，但由于該方法可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及實(shí)現(xiàn)不同批次樣本電泳結(jié)果間的直接比較，因此其檢測(cè)體系一旦被建立，必將替代上述其他2種電泳分析方法。毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)CR擴(kuò)增的特異性要求較高，因此，不能簡(jiǎn)單地將常規(guī)的CR擴(kuò)增條件移植至毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法中[9]。目前在玉米上已初步建立了基于毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法的品種SSR指紋分析技術(shù)[7，9]，但在水稻上，迄今只有篇研究報(bào)道[20]，相關(guān)分子標(biāo)記的擴(kuò)增體系和條件尚有待優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

2SN標(biāo)記及其多態(tài)性檢測(cè)方法

[CM（24]SN（single[KG3]nucleotide[KG2]polymorphism）是指由單核苷酸變[CM）][FL）]

[FK（W4][HT6H][Z][WTHZ]表水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標(biāo)記及其多態(tài)性分析方法比較[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK5，WK，WK9，WK35W]標(biāo)記類型標(biāo)記特點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)多態(tài)性檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)

[BHDG42，WK5，WKZQ2，WK9ZQ0，WK35ZQW]SSR長(zhǎng)度多態(tài)性，數(shù)量較大瓊脂糖凝膠電泳[2]優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、成本低、重復(fù)性好、顯色方便，電泳圖譜中的背景干擾少；根據(jù)代表性品種擴(kuò)增條帶可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的橫向比較。缺點(diǎn)：分辨率低，難以區(qū)分8 bp以內(nèi)的長(zhǎng)度差異；不能給出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度估計(jì)值；不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

[BHDW]聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：分辨率中等，理論上可區(qū)分3 bp以上的長(zhǎng)度差異；根據(jù)代表性品種擴(kuò)增條帶可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的橫向比較。缺點(diǎn)：操作繁瑣、效率低，顯色過(guò)程中容易存在背景干擾；不可給出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度估計(jì)值；不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

[BH]毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，理論上可區(qū)分 bp長(zhǎng)度差異；可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品種可給出擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的估計(jì)值；可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的直接比較。缺點(diǎn)：對(duì)模板質(zhì)量、CR擴(kuò)增特異性要求高；儀器及試劑成本較高

[BH]SN單核苷酸多態(tài)性，數(shù)量巨大，隨機(jī)分布芯片雜交檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：直接給出SN位點(diǎn)中的堿基組成，真正意義上的DNA指紋；容易獲得與重要性狀基因緊密連鎖的SN標(biāo)記，育種利用價(jià)值高；自動(dòng)化和通量化程度極高。缺點(diǎn)：多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開展；試劑成本高[H][BG）F][FK）]

[FL（2K2]

異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式[2-22]。相比于其他DNA標(biāo)記，SN標(biāo)記在任一作物群體中的數(shù)量、基因組覆蓋度和分布頻率均最高，是研究作物品種遺傳多樣性和真?zhèn)涡缘淖罾硐敕肿訕?biāo)記。在水稻基因組中，平均每 kb即存在個(gè)SN位點(diǎn)，暗示絕大多數(shù)基因內(nèi)均存在至少個(gè)SN位點(diǎn)[23-24]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性缺乏高效檢測(cè)技術(shù)一直是限制SN標(biāo)記應(yīng)用的最主要原因。近年來(lái)，隨著DNA微陣列和芯片雜交技術(shù)的快速發(fā)展，SN標(biāo)記在作物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用已成為現(xiàn)實(shí)[23-26]。

基于芯片雜交技術(shù)的SN檢測(cè)方法最顯著優(yōu)勢(shì)是可確定樣本在各SN位點(diǎn)中的具體堿基組成[23]，因而是真正意義上的DNA指紋，這是上述基于SSR標(biāo)記多態(tài)性分析中無(wú)法做到的。另外，張SN芯片上可點(diǎn)陣幾萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)個(gè)標(biāo)記探針，且同時(shí)可對(duì)96個(gè)或384個(gè)樣品進(jìn)行SN分析，因此是真正意義上的高通量、高效率的品種DNA指紋檢測(cè)技術(shù)。例如，對(duì)于張含有2 000個(gè)SN位點(diǎn)的96孔板芯片，次雜交試驗(yàn)可得出96個(gè)樣品中的每個(gè)樣品在2 000個(gè)SN位點(diǎn)中的基因型，檢測(cè)效率極高。在SSR標(biāo)記毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法中，以最新的高通量SSR分析系統(tǒng)（Advanced Analytical公司的Fragment Analyzer系統(tǒng)）為例，該系統(tǒng)一次性可完成0個(gè)標(biāo)記在96個(gè)樣本（0×96孔板）或個(gè)標(biāo)記在960個(gè)樣本上的基因型分析，如果需要完成96個(gè)樣本在2 000個(gè)SSR位點(diǎn)中的基因型分析，則需要至少200次獨(dú)立反應(yīng)，耗時(shí)長(zhǎng)。如果需要增加標(biāo)記個(gè)數(shù)，毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)的工作量會(huì)相應(yīng)增加，相反，對(duì)于SN芯片，其攜帶的標(biāo)記數(shù)不管多少，均是一次性完成，不需增加額外工作量。SN芯片雜交方法的主要缺點(diǎn)是檢測(cè)成本高，且需要在專業(yè)化的芯片服務(wù)公司中進(jìn)行，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開展。

利用SN標(biāo)記構(gòu)建品種DNA指紋的最關(guān)鍵問題是選擇合適的SN位點(diǎn)，這需要行業(yè)內(nèi)的科學(xué)家協(xié)作研究，待位點(diǎn)確定后即可在專業(yè)化芯片公司中制備和規(guī)模化生產(chǎn)SN芯片以及開展后續(xù)的應(yīng)用分析工作[23，27]。在水稻上，美國(guó)康奈爾大學(xué)McCouch實(shí)驗(yàn)室率先在Affymetrix公司定制了含有44萬(wàn)個(gè)SN標(biāo)記的SN芯片，并利用其評(píng)價(jià)了國(guó)際水稻微核心種質(zhì)庫(kù)中的44份種質(zhì)的遺傳多樣性[23]。此外，國(guó)內(nèi)研究者還通過(guò)測(cè)序技術(shù)，對(duì)幾千份國(guó)內(nèi)外水稻品種的基因組序列進(jìn)行了重測(cè)序[28]，這為鑒定出更多有用的SN位點(diǎn)提供了豐富的序列基礎(chǔ)。這些研究表明，通過(guò)SN芯片構(gòu)建水稻品種DNA指紋是切實(shí)可行的。

[WTHZ]2DNA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀

在水稻品種DNA指紋圖譜研究中，莊杰云等[9]通過(guò)58個(gè)候選SSR標(biāo)記和63個(gè)代表性水稻品種為材料，確定了用于鑒定我國(guó)主栽水稻品種的24對(duì)核心SSR標(biāo)記，并率先制定了“水稻品種鑒定DNA指紋方法”國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 433—2007）（以下簡(jiǎn)稱舊標(biāo)準(zhǔn)）[29-30]，這是迄今水稻品種DNA指紋研究中最具代表性的一項(xiàng)工作。除此之外，不少學(xué)者還分別對(duì)不同地區(qū)、不同類型的水稻品種或重要育種材料進(jìn)行了DNA指紋分析。如，肖小余等[0]以四川省主要雜交稻親本為研究對(duì)象，從208對(duì)SSR引物中篩選出了8對(duì)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記，并以此構(gòu)建了四川省26個(gè)主要雜交稻親本材料的SSR指紋圖譜。程本義等[3]、陳英華等[32]、楊旭等[33]分別構(gòu)建了浙江省、東北地區(qū)和云貴地區(qū)的相關(guān)水稻品種（系）的SSR指紋。顏靜宛等[34]和田大剛等[34-35]先后開發(fā)并驗(yàn)證了用于鑒別我國(guó)雜交稻品種及其主要親本材料的24對(duì)核心SSR標(biāo)記，并認(rèn)為可將此24對(duì)標(biāo)記與莊杰云等[9]制定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的24對(duì)標(biāo)記結(jié)合使用，以增加品種鑒定的準(zhǔn)確性。目前，農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站上已顯示有一套新的“水稻品種鑒定SSR標(biāo)記法”正待審批[30]，該標(biāo)準(zhǔn)將替代2007年制定的舊標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)于舊標(biāo)準(zhǔn)，新標(biāo)準(zhǔn)中的標(biāo)記數(shù)目增加倍，這無(wú)疑將大大提高新標(biāo)準(zhǔn)的鑒別力，但究竟是否適用于全國(guó)各地的不同水稻品種鑒定仍有待實(shí)踐檢驗(yàn)。作者在利用新標(biāo)準(zhǔn)中的48對(duì)SSR標(biāo)記鑒別江蘇近5年審定的粳稻品種時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中有26個(gè)標(biāo)記在供試品種間沒有多態(tài)性，且有2個(gè)品種無(wú)法采用48對(duì)標(biāo)記進(jìn)行鑒別，這表明新標(biāo)準(zhǔn)在鑒別局部地區(qū)品種上仍有待發(fā)展。

總體而言，在水稻品種DNA指紋鑒別上，至今未能形成一個(gè)廣適性的標(biāo)準(zhǔn)。究其原因，可能有以下2個(gè)方面：一是研究中選用的樣本數(shù)少、來(lái)源地窄，導(dǎo)致獲得的核心SSR標(biāo)記的代表性不足，往往只能用于當(dāng)?shù)仄贩N鑒別，一旦擴(kuò)大到其他區(qū)域或增加品種數(shù)量時(shí)，便出現(xiàn)核心SSR標(biāo)記并不核心的現(xiàn)象；二是我國(guó)絕大多數(shù)水稻品種間的遺傳基礎(chǔ)窄，尤其是不同省內(nèi)審定的適用于特定生態(tài)區(qū)內(nèi)種植的品種[6]，遺傳多樣性更低，這導(dǎo)致基于不同生態(tài)區(qū)間的品種研發(fā)的多態(tài)性SSR標(biāo)記在一些省內(nèi)審定品種間沒有多態(tài)性。

鑒于此，作者認(rèn)為以SSR標(biāo)記建立水稻品種DNA指紋檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值得商榷，因?yàn)楹诵腟SR標(biāo)記庫(kù)是個(gè)動(dòng)態(tài)擴(kuò)充庫(kù)，而不是一成不變的，即會(huì)隨著樣本量的不斷增加而需要不斷更換或增加新標(biāo)記。如果以此標(biāo)記建立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)因?yàn)椴煌貐^(qū)需要增加或更換標(biāo)記，而經(jīng)常性地反復(fù)修訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。相反，如果利用SSR標(biāo)記建立地方（或省級(jí)）標(biāo)準(zhǔn)，則不會(huì)因?yàn)槟硞€(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)的修訂而影響到其他地方標(biāo)準(zhǔn)的使用，影響面小。

3建立國(guó)家和省級(jí)兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

3建立“水稻品種高密度SN標(biāo)記指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

水稻育種的核心競(jìng)爭(zhēng)力在于優(yōu)異育種中間材料的創(chuàng)新上，我國(guó)水稻育種在過(guò)去幾十年的發(fā)展中，先后培育出了大量原創(chuàng)性優(yōu)異育種材料，為我國(guó)水稻不斷增產(chǎn)豐收作出了巨大貢獻(xiàn)[36]。近年來(lái)，一些國(guó)際種業(yè)巨頭不斷增加在我國(guó)開展水稻育種的科研投入，同時(shí)，國(guó)內(nèi)一些種業(yè)企業(yè)也主動(dòng)參與到國(guó)外水稻育種中，造成我國(guó)水稻育種材料的流失。因此，從參與國(guó)際紛爭(zhēng)中可能存在的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)考慮，我國(guó)需要建立一個(gè)“水稻品種鑒定DNA指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[，36]。

作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，必須保證所有品種或重要育種材料的DNA指紋具有“永久唯一性”特征，即不能隨著新品種或樣本量的增加而出現(xiàn)同一品種不同指紋或不同品種相同指紋的現(xiàn)象。解決此問題的唯一策略是，采用足夠多的分子標(biāo)記構(gòu)建品種DNA指紋，而不是以少數(shù)核心分子標(biāo)記（如核心SSR標(biāo)記）進(jìn)行。當(dāng)標(biāo)記數(shù)量足夠大時(shí)，采用SN標(biāo)記是唯一可行的辦法，因此，可利用SN標(biāo)記建立“水稻品種高密度SN標(biāo)記指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于解決國(guó)際間品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)紛爭(zhēng)中以及分子設(shè)計(jì)育種過(guò)程中。

構(gòu)建水稻品種高密度的SN指紋數(shù)據(jù)庫(kù)具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（）構(gòu)建的各品種DNA指紋可做到“永久唯一性”，在品種權(quán)保護(hù)和權(quán)益紛爭(zhēng)時(shí)可為育種者提供重要的裁定證據(jù)[，36]；（2）隨著標(biāo)記密度的增高，可將標(biāo)記與特定基因建立有機(jī)聯(lián)系，有利于育種工作者結(jié)合SN指紋開展分子設(shè)計(jì)育種，如設(shè)計(jì)配組方式、制定選擇目標(biāo)[2，24]；（3）有利于從國(guó)家層面上及時(shí)了解不同時(shí)期或不同地區(qū)內(nèi)育成品種間的遺傳多樣性，為國(guó)家適時(shí)制定育種策略以豐富品種多樣性、提高品種抗風(fēng)險(xiǎn)能力提供參考[2，24]。

32建立“水稻品種核心SSR標(biāo)記指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

盡管構(gòu)建全國(guó)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的品種高密度SN指紋十分必要，但由于其成本高、一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法完成檢測(cè)分析工作，使得SN指紋檢測(cè)技術(shù)不適宜在品種參試、審定和市場(chǎng)監(jiān)管等常規(guī)環(huán)節(jié)中使用。相反，這些環(huán)節(jié)的有效管理是從源頭上控制我國(guó)品種審定及種業(yè)市場(chǎng)中的各種違規(guī)違法現(xiàn)象的重要措施。因此，為了常規(guī)的監(jiān)督管理，需要建立一個(gè)高效、簡(jiǎn)便、低成本的水稻品種鑒定DNA指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

相比于SN標(biāo)記，SSR標(biāo)記的檢測(cè)工作可在一般實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成、操作簡(jiǎn)便，可用于快速鑒定水稻品種（系）的真?zhèn)涡訹5，9，5]。然而，正如前文所述，對(duì)于種植地域性較強(qiáng)的水稻，不適宜構(gòu)建全國(guó)統(tǒng)一的SSR指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。但是，可開發(fā)適用于地方品種特異性鑒別的核心SSR標(biāo)記，以建立“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于地方品種參試、種子生產(chǎn)銷售中的各種違規(guī)違法現(xiàn)象的監(jiān)管中。

33國(guó)家和地方兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用策略

由于國(guó)家和地方兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)間的應(yīng)用側(cè)重點(diǎn)不同，筆者根據(jù)各自的特點(diǎn)，提出在品種培育、品種審定、品種權(quán)保護(hù)和市場(chǎng)監(jiān)管環(huán)節(jié)中差別化應(yīng)用DNA指紋兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的策略（圖），為規(guī)范化兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考。

[FK（W7][TZSMtif][FK）]

品種培育是種業(yè)發(fā)展壯大的根本[36]。建議制定國(guó)家規(guī)程，要求經(jīng)過(guò)各級(jí)政府審定或認(rèn)定的水稻新品種（系）均要在指定機(jī)構(gòu)、采用國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建相應(yīng)品種（系）的高密度SN指紋，并將品種SN指紋設(shè)為獲得新品種權(quán)的重要條件。對(duì)于培育的重要育種中間材料，育種者可根據(jù)自行需要申請(qǐng)構(gòu)建其SN指紋，以防相應(yīng)材料的外流或被盜。建立所有審定品種或重要育種中間材料的高密度SN指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于為育種工作者提供重要育種材料的遺傳信息（如控制病蟲害抗性、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等性狀的基因位置及供體親本），并根據(jù)這些信息選擇配組親本，開展分子設(shè)計(jì)育種，提高選擇效率[2，24]，實(shí)現(xiàn)品種DNA指紋與育種工作間的有機(jī)聯(lián)系。

品種審定由國(guó)家或省級(jí)種子管理部門負(fù)責(zé)，其中的關(guān)鍵是遏制品系參試過(guò)程中的違規(guī)現(xiàn)象。建議各省級(jí)種子管理部門均需制定適用于相應(yīng)省的“水稻品種鑒定——SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于相應(yīng)省內(nèi)區(qū)試品系真?zhèn)涡缘目焖勹b定[5，9，5]。對(duì)于通過(guò)審定的品種，按國(guó)家和地方兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別構(gòu)建其DNA指紋，其中國(guó)家的SN指紋主要用于品種培育及在侵權(quán)違法事件中地方標(biāo)準(zhǔn)不能解決的情況下和國(guó)際性知識(shí)產(chǎn)權(quán)紛爭(zhēng)中使用，地方的SSR指紋主要在種子監(jiān)管及常規(guī)的侵權(quán)違規(guī)違法事件中使用。

品種權(quán)保護(hù)可采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的SN指紋和地方標(biāo)準(zhǔn)中的SSR指紋同時(shí)進(jìn)行，以確保品種在國(guó)內(nèi)外種子市場(chǎng)及育種利用等不同環(huán)節(jié)中得到合法保護(hù)[，36]。

市場(chǎng)監(jiān)管主要是保證種子市場(chǎng)中的種子純度和真實(shí)性。當(dāng)前種子市場(chǎng)中普遍存在套牌侵權(quán)、以次充好、銷售假劣種子等違規(guī)違法現(xiàn)象[，36]。建議將“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)全程應(yīng)用于種子市場(chǎng)監(jiān)管的各個(gè)環(huán)節(jié)中，以快速鑒定種子純度和真?zhèn)涡裕驌舴N子市場(chǎng)中相關(guān)違規(guī)違法現(xiàn)象，確保健康、公平公正的種業(yè)市場(chǎng)環(huán)境[36]。

[WTHZ]4水稻品種DNA指紋構(gòu)建及應(yīng)用中仍需研究的問題

4高密度SN芯片定制中的SN位點(diǎn)篩選

構(gòu)建品種高密度SN指紋的最重要價(jià)值是將其應(yīng)用于品種培育環(huán)節(jié)中，要達(dá)到此目的的關(guān)鍵是，建立SN標(biāo)記與重要性狀基因間的關(guān)聯(lián)[24-27]。這要求在定制SN芯片時(shí)，盡可能多地將位于重要性狀（抗性、高產(chǎn)、品質(zhì)等）基因內(nèi)或與其緊密連鎖的SN位點(diǎn)作為首先位點(diǎn)[24]；另外需要考慮標(biāo)記的密度，水稻中平均每0 kb左右存在個(gè)基因，因此可按照每0 kb至少個(gè)標(biāo)記的密度篩選SN標(biāo)記。毋庸置疑，篩選合適的、有價(jià)值的SN標(biāo)記是構(gòu)建品種SN指紋的最重要環(huán)節(jié)，這需要不同領(lǐng)域?qū)W者間合作進(jìn)行，目前我國(guó)已在這一方面啟動(dòng)了國(guó)家級(jí)重大研究課題，相信在幾年內(nèi)SN芯片定會(huì)在我國(guó)水稻品種SN指紋構(gòu)建及分子設(shè)計(jì)育種中得以應(yīng)用。

42高密度SN指紋數(shù)據(jù)在品種培育中的應(yīng)用

傳統(tǒng)育種在親本配組和個(gè)體選擇上主要依賴育種者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，基本不考慮配組親本或個(gè)體的基因型信息；現(xiàn)代分子設(shè)計(jì)育種則強(qiáng)調(diào)根據(jù)基因型開展程序化和標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)化育種，要求盡量降低育種者的選擇經(jīng)驗(yàn)性[24]。品種高密度SN指紋數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，將為育種者結(jié)合基因型信息選擇配組親本及目標(biāo)個(gè)體提供依據(jù)，但育種者如何讀懂如此海量數(shù)據(jù)的SN信息并將其與育種目標(biāo)及重要基因間建立聯(lián)系，將是利用SN指紋數(shù)據(jù)開展分子設(shè)計(jì)育種中需要不斷研究的問題[37]。

43判定為不同品種的差異SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)

已公布的國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，樣本間差異位點(diǎn)≥2時(shí)判定為不同品種、等于時(shí)判定為相似品種、等于0時(shí)判定為相同品種。由于絕大多數(shù)品種內(nèi)均存在一定的剩余變異，即純是相對(duì)的。剩余變異的存在會(huì)導(dǎo)致同一品種在不同批次的SSR指紋檢測(cè)結(jié)果間存在個(gè)別或少數(shù)位點(diǎn)差異。因此，僅以被檢品種在核心SSR標(biāo)記上的指紋與數(shù)據(jù)庫(kù)中授權(quán)品種的DNA指紋達(dá)到高度相似或相同就判定兩者為同一品種是危險(xiǎn)的[，36]。實(shí)際上，究竟以多少個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)為閾值判定不同品種，是需要在實(shí)踐中以大量品種作為材料進(jìn)行反復(fù)抽樣研究后統(tǒng)計(jì)確定的。在當(dāng)前情況下，對(duì)“相似”品種結(jié)合農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒別也是十分必要的。

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品種是指人類在一定的生態(tài)條件和經(jīng)濟(jì)條件下，根據(jù)人類的需要所選育的某種作物的一定群體，它具備相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特性，在生物學(xué)、形態(tài)學(xué)及經(jīng)濟(jì)性狀上具有相對(duì)一致性，與同一作物的其他群體在特征、特性上有所區(qū)別即特異性，在產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)等方面都能符合相應(yīng)地區(qū)的生產(chǎn)發(fā)展需要。作物優(yōu)良品種的選育和推廣是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)的重要支撐，是確保我國(guó)糧食安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)植物品種進(jìn)行DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）測(cè)試一直是新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[2-3]。DUS測(cè)試主要以田間種植鑒定為主，即根據(jù)品種間的田間表型差異判定新品種是否有別于其他品種[2-3]。由于DUS測(cè)試周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響、工作量大，加上新品種數(shù)量越來(lái)越多，導(dǎo)致在實(shí)踐中無(wú)法通過(guò)DUS測(cè)試確定新品種是否有別于現(xiàn)有的所有品種，以及在違規(guī)經(jīng)營(yíng)中究竟侵犯了哪個(gè)品種，此外鑒定結(jié)果也嚴(yán)重滯后，影響了執(zhí)法效率[3]。研究表明，DNA分子標(biāo)記可應(yīng)用于品種真實(shí)性鑒定、審定監(jiān)管等各個(gè)環(huán)節(jié)，其具備鑒定效率高、周期短、結(jié)果準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)[4-8]。在水稻上，迄今尚未形成一個(gè)廣適性的品種SSR指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[9-]。本文對(duì)DNA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行分析，提出構(gòu)建國(guó)家和省級(jí)兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的建議及構(gòu)建策略，以期為不同領(lǐng)域的研究和管理人員理解DNA指紋并盡快建立標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用規(guī)程提供幫助。

[WTHZ]水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標(biāo)記

SSR標(biāo)記及其多態(tài)性分析方法

SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，一般是由2～4個(gè)核苷酸為重復(fù)單位（基序，motif）組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，如（AT）n、（GCA）n等，其中n表示重復(fù)次數(shù)，其在同一物種不同基因型品種間的差異較大，并造成SSR長(zhǎng)度多態(tài)性[5，]。SSR位點(diǎn)兩端多是保守的單拷貝序列，因此，可用兩側(cè)的保守序列開發(fā)特異CR引物，并通過(guò)CR和凝膠電泳技術(shù)，顯示SSR位點(diǎn)在品種/個(gè)體間的多態(tài)性。由于生物基因組中存在非常豐富的SSR位點(diǎn)、數(shù)量龐大，理論上分布于整個(gè)基因組的不同位置上，因而，基于SSR位點(diǎn)的分子標(biāo)記可用于鑒別品種的遺傳多樣性。隨著水稻基因組序列的測(cè)序完成，水稻基因組中被發(fā)現(xiàn)存在超過(guò)8 000個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每25 kb就存在個(gè)SSR位點(diǎn)[2-3]，這為利用SSR標(biāo)記研究水稻品種間的遺傳多樣性以及品種真?zhèn)涡蕴峁┝素S富的標(biāo)記基礎(chǔ)。

SSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、效率高、重演性強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位和標(biāo)記輔助育種等眾多領(lǐng)域，也是當(dāng)前主要農(nóng)作物品種（如玉米、水稻、大豆）真?zhèn)涡澡b定中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[，4-7]。SSR標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)可采用瓊脂糖凝膠電泳、（變性或非變性）聚丙烯胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法進(jìn)行[5，7-20]，各方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表。比較而言，毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)方法的分辨率最高[9-20]，理論上可達(dá)到 bp，盡管當(dāng)前的儀器設(shè)備和試劑成本較高，但由于該方法可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及實(shí)現(xiàn)不同批次樣本電泳結(jié)果間的直接比較，因此其檢測(cè)體系一旦被建立，必將替代上述其他2種電泳分析方法。毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)CR擴(kuò)增的特異性要求較高，因此，不能簡(jiǎn)單地將常規(guī)的CR擴(kuò)增條件移植至毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法中[9]。目前在玉米上已初步建立了基于毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法的品種SSR指紋分析技術(shù)[7，9]，但在水稻上，迄今只有篇研究報(bào)道[20]，相關(guān)分子標(biāo)記的擴(kuò)增體系和條件尚有待優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

2SN標(biāo)記及其多態(tài)性檢測(cè)方法

[CM（24]SN（single[KG3]nucleotide[KG2]polymorphism）是指由單核苷酸變[CM）][FL）]

[FK（W4][HT6H][Z][WTHZ]表水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標(biāo)記及其多態(tài)性分析方法比較[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK5，WK，WK9，WK35W]標(biāo)記類型標(biāo)記特點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)多態(tài)性檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)

[BHDG42，WK5，WKZQ2，WK9ZQ0，WK35ZQW]SSR長(zhǎng)度多態(tài)性，數(shù)量較大瓊脂糖凝膠電泳[2]優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、成本低、重復(fù)性好、顯色方便，電泳圖譜中的背景干擾少；根據(jù)代表性品種擴(kuò)增條帶可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的橫向比較。缺點(diǎn)：分辨率低，難以區(qū)分8 bp以內(nèi)的長(zhǎng)度差異；不能給出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度估計(jì)值；不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

[BHDW]聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：分辨率中等，理論上可區(qū)分3 bp以上的長(zhǎng)度差異；根據(jù)代表性品種擴(kuò)增條帶可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的橫向比較。缺點(diǎn)：操作繁瑣、效率低，顯色過(guò)程中容易存在背景干擾；不可給出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度估計(jì)值；不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

[BH]毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，理論上可區(qū)分 bp長(zhǎng)度差異；可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品種可給出擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的估計(jì)值；可實(shí)現(xiàn)不同批次結(jié)果間的直接比較。缺點(diǎn)：對(duì)模板質(zhì)量、CR擴(kuò)增特異性要求高；儀器及試劑成本較高

[BH]SN單核苷酸多態(tài)性，數(shù)量巨大，隨機(jī)分布芯片雜交檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：直接給出SN位點(diǎn)中的堿基組成，真正意義上的DNA指紋；容易獲得與重要性狀基因緊密連鎖的SN標(biāo)記，育種利用價(jià)值高；自動(dòng)化和通量化程度極高。缺點(diǎn)：多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開展；試劑成本高[H][BG）F][FK）]

[FL（2K2]

異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式[2-22]。相比于其他DNA標(biāo)記，SN標(biāo)記在任一作物群體中的數(shù)量、基因組覆蓋度和分布頻率均最高，是研究作物品種遺傳多樣性和真?zhèn)涡缘淖罾硐敕肿訕?biāo)記。在水稻基因組中，平均每 kb即存在個(gè)SN位點(diǎn)，暗示絕大多數(shù)基因內(nèi)均存在至少個(gè)SN位點(diǎn)[23-24]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性缺乏高效檢測(cè)技術(shù)一直是限制SN標(biāo)記應(yīng)用的最主要原因。近年來(lái)，隨著DNA微陣列和芯片雜交技術(shù)的快速發(fā)展，SN標(biāo)記在作物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用已成為現(xiàn)實(shí)[23-26]。

基于芯片雜交技術(shù)的SN檢測(cè)方法最顯著優(yōu)勢(shì)是可確定樣本在各SN位點(diǎn)中的具體堿基組成[23]，因而是真正意義上的DNA指紋，這是上述基于SSR標(biāo)記多態(tài)性分析中無(wú)法做到的。另外，張SN芯片上可點(diǎn)陣幾萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)個(gè)標(biāo)記探針，且同時(shí)可對(duì)96個(gè)或384個(gè)樣品進(jìn)行SN分析，因此是真正意義上的高通量、高效率的品種DNA指紋檢測(cè)技術(shù)。例如，對(duì)于張含有2 000個(gè)SN位點(diǎn)的96孔板芯片，次雜交試驗(yàn)可得出96個(gè)樣品中的每個(gè)樣品在2 000個(gè)SN位點(diǎn)中的基因型，檢測(cè)效率極高。在SSR標(biāo)記毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法中，以最新的高通量SSR分析系統(tǒng)（Advanced Analytical公司的Fragment Analyzer系統(tǒng)）為例，該系統(tǒng)一次性可完成0個(gè)標(biāo)記在96個(gè)樣本（0×96孔板）或個(gè)標(biāo)記在960個(gè)樣本上的基因型分析，如果需要完成96個(gè)樣本在2 000個(gè)SSR位點(diǎn)中的基因型分析，則需要至少200次獨(dú)立反應(yīng)，耗時(shí)長(zhǎng)。如果需要增加標(biāo)記個(gè)數(shù)，毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)的工作量會(huì)相應(yīng)增加，相反，對(duì)于SN芯片，其攜帶的標(biāo)記數(shù)不管多少，均是一次性完成，不需增加額外工作量。SN芯片雜交方法的主要缺點(diǎn)是檢測(cè)成本高，且需要在專業(yè)化的芯片服務(wù)公司中進(jìn)行，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開展。

利用SN標(biāo)記構(gòu)建品種DNA指紋的最關(guān)鍵問題是選擇合適的SN位點(diǎn)，這需要行業(yè)內(nèi)的科學(xué)家協(xié)作研究，待位點(diǎn)確定后即可在專業(yè)化芯片公司中制備和規(guī)模化生產(chǎn)SN芯片以及開展后續(xù)的應(yīng)用分析工作[23，27]。在水稻上，美國(guó)康奈爾大學(xué)McCouch實(shí)驗(yàn)室率先在Affymetrix公司定制了含有44萬(wàn)個(gè)SN標(biāo)記的SN芯片，并利用其評(píng)價(jià)了國(guó)際水稻微核心種質(zhì)庫(kù)中的44份種質(zhì)的遺傳多樣性[23]。此外，國(guó)內(nèi)研究者還通過(guò)測(cè)序技術(shù)，對(duì)幾千份國(guó)內(nèi)外水稻品種的基因組序列進(jìn)行了重測(cè)序[28]，這為鑒定出更多有用的SN位點(diǎn)提供了豐富的序列基礎(chǔ)。這些研究表明，通過(guò)SN芯片構(gòu)建水稻品種DNA指紋是切實(shí)可行的。

[WTHZ]2DNA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀

在水稻品種DNA指紋圖譜研究中，莊杰云等[9]通過(guò)58個(gè)候選SSR標(biāo)記和63個(gè)代表性水稻品種為材料，確定了用于鑒定我國(guó)主栽水稻品種的24對(duì)核心SSR標(biāo)記，并率先制定了“水稻品種鑒定DNA指紋方法”國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 433—2007）（以下簡(jiǎn)稱舊標(biāo)準(zhǔn)）[29-30]，這是迄今水稻品種DNA指紋研究中最具代表性的一項(xiàng)工作。除此之外，不少學(xué)者還分別對(duì)不同地區(qū)、不同類型的水稻品種或重要育種材料進(jìn)行了DNA指紋分析。如，肖小余等[0]以四川省主要雜交稻親本為研究對(duì)象，從208對(duì)SSR引物中篩選出了8對(duì)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記，并以此構(gòu)建了四川省26個(gè)主要雜交稻親本材料的SSR指紋圖譜。程本義等[3]、陳英華等[32]、楊旭等[33]分別構(gòu)建了浙江省、東北地區(qū)和云貴地區(qū)的相關(guān)水稻品種（系）的SSR指紋。顏靜宛等[34]和田大剛等[34-35]先后開發(fā)并驗(yàn)證了用于鑒別我國(guó)雜交稻品種及其主要親本材料的24對(duì)核心SSR標(biāo)記，并認(rèn)為可將此24對(duì)標(biāo)記與莊杰云等[9]制定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的24對(duì)標(biāo)記結(jié)合使用，以增加品種鑒定的準(zhǔn)確性。目前，農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站上已顯示有一套新的“水稻品種鑒定SSR標(biāo)記法”正待審批[30]，該標(biāo)準(zhǔn)將替代2007年制定的舊標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)于舊標(biāo)準(zhǔn)，新標(biāo)準(zhǔn)中的標(biāo)記數(shù)目增加倍，這無(wú)疑將大大提高新標(biāo)準(zhǔn)的鑒別力，但究竟是否適用于全國(guó)各地的不同水稻品種鑒定仍有待實(shí)踐檢驗(yàn)。作者在利用新標(biāo)準(zhǔn)中的48對(duì)SSR標(biāo)記鑒別江蘇近5年審定的粳稻品種時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中有26個(gè)標(biāo)記在供試品種間沒有多態(tài)性，且有2個(gè)品種無(wú)法采用48對(duì)標(biāo)記進(jìn)行鑒別，這表明新標(biāo)準(zhǔn)在鑒別局部地區(qū)品種上仍有待發(fā)展。

總體而言，在水稻品種DNA指紋鑒別上，至今未能形成一個(gè)廣適性的標(biāo)準(zhǔn)。究其原因，可能有以下2個(gè)方面：一是研究中選用的樣本數(shù)少、來(lái)源地窄，導(dǎo)致獲得的核心SSR標(biāo)記的代表性不足，往往只能用于當(dāng)?shù)仄贩N鑒別，一旦擴(kuò)大到其他區(qū)域或增加品種數(shù)量時(shí)，便出現(xiàn)核心SSR標(biāo)記并不核心的現(xiàn)象；二是我國(guó)絕大多數(shù)水稻品種間的遺傳基礎(chǔ)窄，尤其是不同省內(nèi)審定的適用于特定生態(tài)區(qū)內(nèi)種植的品種[6]，遺傳多樣性更低，這導(dǎo)致基于不同生態(tài)區(qū)間的品種研發(fā)的多態(tài)性SSR標(biāo)記在一些省內(nèi)審定品種間沒有多態(tài)性。

鑒于此，作者認(rèn)為以SSR標(biāo)記建立水稻品種DNA指紋檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值得商榷，因?yàn)楹诵腟SR標(biāo)記庫(kù)是個(gè)動(dòng)態(tài)擴(kuò)充庫(kù)，而不是一成不變的，即會(huì)隨著樣本量的不斷增加而需要不斷更換或增加新標(biāo)記。如果以此標(biāo)記建立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)因?yàn)椴煌貐^(qū)需要增加或更換標(biāo)記，而經(jīng)常性地反復(fù)修訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。相反，如果利用SSR標(biāo)記建立地方（或省級(jí)）標(biāo)準(zhǔn)，則不會(huì)因?yàn)槟硞€(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)的修訂而影響到其他地方標(biāo)準(zhǔn)的使用，影響面小。

3建立國(guó)家和省級(jí)兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

3建立“水稻品種高密度SN標(biāo)記指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

水稻育種的核心競(jìng)爭(zhēng)力在于優(yōu)異育種中間材料的創(chuàng)新上，我國(guó)水稻育種在過(guò)去幾十年的發(fā)展中，先后培育出了大量原創(chuàng)性優(yōu)異育種材料，為我國(guó)水稻不斷增產(chǎn)豐收作出了巨大貢獻(xiàn)[36]。近年來(lái)，一些國(guó)際種業(yè)巨頭不斷增加在我國(guó)開展水稻育種的科研投入，同時(shí)，國(guó)內(nèi)一些種業(yè)企業(yè)也主動(dòng)參與到國(guó)外水稻育種中，造成我國(guó)水稻育種材料的流失。因此，從參與國(guó)際紛爭(zhēng)中可能存在的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)考慮，我國(guó)需要建立一個(gè)“水稻品種鑒定DNA指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[，36]。

作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，必須保證所有品種或重要育種材料的DNA指紋具有“永久唯一性”特征，即不能隨著新品種或樣本量的增加而出現(xiàn)同一品種不同指紋或不同品種相同指紋的現(xiàn)象。解決此問題的唯一策略是，采用足夠多的分子標(biāo)記構(gòu)建品種DNA指紋，而不是以少數(shù)核心分子標(biāo)記（如核心SSR標(biāo)記）進(jìn)行。當(dāng)標(biāo)記數(shù)量足夠大時(shí)，采用SN標(biāo)記是唯一可行的辦法，因此，可利用SN標(biāo)記建立“水稻品種高密度SN標(biāo)記指紋”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于解決國(guó)際間品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)紛爭(zhēng)中以及分子設(shè)計(jì)育種過(guò)程中。

構(gòu)建水稻品種高密度的SN指紋數(shù)據(jù)庫(kù)具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（）構(gòu)建的各品種DNA指紋可做到“永久唯一性”，在品種權(quán)保護(hù)和權(quán)益紛爭(zhēng)時(shí)可為育種者提供重要的裁定證據(jù)[，36]；（2）隨著標(biāo)記密度的增高，可將標(biāo)記與特定基因建立有機(jī)聯(lián)系，有利于育種工作者結(jié)合SN指紋開展分子設(shè)計(jì)育種，如設(shè)計(jì)配組方式、制定選擇目標(biāo)[2，24]；（3）有利于從國(guó)家層面上及時(shí)了解不同時(shí)期或不同地區(qū)內(nèi)育成品種間的遺傳多樣性，為國(guó)家適時(shí)制定育種策略以豐富品種多樣性、提高品種抗風(fēng)險(xiǎn)能力提供參考[2，24]。

32建立“水稻品種核心SSR標(biāo)記指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)的必要性和策略

盡管構(gòu)建全國(guó)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的品種高密度SN指紋十分必要，但由于其成本高、一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法完成檢測(cè)分析工作，使得SN指紋檢測(cè)技術(shù)不適宜在品種參試、審定和市場(chǎng)監(jiān)管等常規(guī)環(huán)節(jié)中使用。相反，這些環(huán)節(jié)的有效管理是從源頭上控制我國(guó)品種審定及種業(yè)市場(chǎng)中的各種違規(guī)違法現(xiàn)象的重要措施。因此，為了常規(guī)的監(jiān)督管理，需要建立一個(gè)高效、簡(jiǎn)便、低成本的水稻品種鑒定DNA指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

相比于SN標(biāo)記，SSR標(biāo)記的檢測(cè)工作可在一般實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成、操作簡(jiǎn)便，可用于快速鑒定水稻品種（系）的真?zhèn)涡訹5，9，5]。然而，正如前文所述，對(duì)于種植地域性較強(qiáng)的水稻，不適宜構(gòu)建全國(guó)統(tǒng)一的SSR指紋檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。但是，可開發(fā)適用于地方品種特異性鑒別的核心SSR標(biāo)記，以建立“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于地方品種參試、種子生產(chǎn)銷售中的各種違規(guī)違法現(xiàn)象的監(jiān)管中。

33國(guó)家和地方兩級(jí)DNA指紋標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用策略

由于國(guó)家和地方兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)間的應(yīng)用側(cè)重點(diǎn)不同，筆者根據(jù)各自的特點(diǎn)，提出在品種培育、品種審定、品種權(quán)保護(hù)和市場(chǎng)監(jiān)管環(huán)節(jié)中差別化應(yīng)用DNA指紋兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的策略（圖），為規(guī)范化兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考。

[FK（W7][TZSMtif][FK）]

品種培育是種業(yè)發(fā)展壯大的根本[36]。建議制定國(guó)家規(guī)程，要求經(jīng)過(guò)各級(jí)政府審定或認(rèn)定的水稻新品種（系）均要在指定機(jī)構(gòu)、采用國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建相應(yīng)品種（系）的高密度SN指紋，并將品種SN指紋設(shè)為獲得新品種權(quán)的重要條件。對(duì)于培育的重要育種中間材料，育種者可根據(jù)自行需要申請(qǐng)構(gòu)建其SN指紋，以防相應(yīng)材料的外流或被盜。建立所有審定品種或重要育種中間材料的高密度SN指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于為育種工作者提供重要育種材料的遺傳信息（如控制病蟲害抗性、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等性狀的基因位置及供體親本），并根據(jù)這些信息選擇配組親本，開展分子設(shè)計(jì)育種，提高選擇效率[2，24]，實(shí)現(xiàn)品種DNA指紋與育種工作間的有機(jī)聯(lián)系。

品種審定由國(guó)家或省級(jí)種子管理部門負(fù)責(zé)，其中的關(guān)鍵是遏制品系參試過(guò)程中的違規(guī)現(xiàn)象。建議各省級(jí)種子管理部門均需制定適用于相應(yīng)省的“水稻品種鑒定——SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)，并將其應(yīng)用于相應(yīng)省內(nèi)區(qū)試品系真?zhèn)涡缘目焖勹b定[5，9，5]。對(duì)于通過(guò)審定的品種，按國(guó)家和地方兩級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別構(gòu)建其DNA指紋，其中國(guó)家的SN指紋主要用于品種培育及在侵權(quán)違法事件中地方標(biāo)準(zhǔn)不能解決的情況下和國(guó)際性知識(shí)產(chǎn)權(quán)紛爭(zhēng)中使用，地方的SSR指紋主要在種子監(jiān)管及常規(guī)的侵權(quán)違規(guī)違法事件中使用。

品種權(quán)保護(hù)可采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的SN指紋和地方標(biāo)準(zhǔn)中的SSR指紋同時(shí)進(jìn)行，以確保品種在國(guó)內(nèi)外種子市場(chǎng)及育種利用等不同環(huán)節(jié)中得到合法保護(hù)[，36]。

市場(chǎng)監(jiān)管主要是保證種子市場(chǎng)中的種子純度和真實(shí)性。當(dāng)前種子市場(chǎng)中普遍存在套牌侵權(quán)、以次充好、銷售假劣種子等違規(guī)違法現(xiàn)象[，36]。建議將“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標(biāo)準(zhǔn)全程應(yīng)用于種子市場(chǎng)監(jiān)管的各個(gè)環(huán)節(jié)中，以快速鑒定種子純度和真?zhèn)涡裕驌舴N子市場(chǎng)中相關(guān)違規(guī)違法現(xiàn)象，確保健康、公平公正的種業(yè)市場(chǎng)環(huán)境[36]。

[WTHZ]4水稻品種DNA指紋構(gòu)建及應(yīng)用中仍需研究的問題

4高密度SN芯片定制中的SN位點(diǎn)篩選

構(gòu)建品種高密度SN指紋的最重要價(jià)值是將其應(yīng)用于品種培育環(huán)節(jié)中，要達(dá)到此目的的關(guān)鍵是，建立SN標(biāo)記與重要性狀基因間的關(guān)聯(lián)[24-27]。這要求在定制SN芯片時(shí)，盡可能多地將位于重要性狀（抗性、高產(chǎn)、品質(zhì)等）基因內(nèi)或與其緊密連鎖的SN位點(diǎn)作為首先位點(diǎn)[24]；另外需要考慮標(biāo)記的密度，水稻中平均每0 kb左右存在個(gè)基因，因此可按照每0 kb至少個(gè)標(biāo)記的密度篩選SN標(biāo)記。毋庸置疑，篩選合適的、有價(jià)值的SN標(biāo)記是構(gòu)建品種SN指紋的最重要環(huán)節(jié)，這需要不同領(lǐng)域?qū)W者間合作進(jìn)行，目前我國(guó)已在這一方面啟動(dòng)了國(guó)家級(jí)重大研究課題，相信在幾年內(nèi)SN芯片定會(huì)在我國(guó)水稻品種SN指紋構(gòu)建及分子設(shè)計(jì)育種中得以應(yīng)用。

42高密度SN指紋數(shù)據(jù)在品種培育中的應(yīng)用

傳統(tǒng)育種在親本配組和個(gè)體選擇上主要依賴育種者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，基本不考慮配組親本或個(gè)體的基因型信息；現(xiàn)代分子設(shè)計(jì)育種則強(qiáng)調(diào)根據(jù)基因型開展程序化和標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)化育種，要求盡量降低育種者的選擇經(jīng)驗(yàn)性[24]。品種高密度SN指紋數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，將為育種者結(jié)合基因型信息選擇配組親本及目標(biāo)個(gè)體提供依據(jù)，但育種者如何讀懂如此海量數(shù)據(jù)的SN信息并將其與育種目標(biāo)及重要基因間建立聯(lián)系，將是利用SN指紋數(shù)據(jù)開展分子設(shè)計(jì)育種中需要不斷研究的問題[37]。

43判定為不同品種的差異SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)

已公布的國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，樣本間差異位點(diǎn)≥2時(shí)判定為不同品種、等于時(shí)判定為相似品種、等于0時(shí)判定為相同品種。由于絕大多數(shù)品種內(nèi)均存在一定的剩余變異，即純是相對(duì)的。剩余變異的存在會(huì)導(dǎo)致同一品種在不同批次的SSR指紋檢測(cè)結(jié)果間存在個(gè)別或少數(shù)位點(diǎn)差異。因此，僅以被檢品種在核心SSR標(biāo)記上的指紋與數(shù)據(jù)庫(kù)中授權(quán)品種的DNA指紋達(dá)到高度相似或相同就判定兩者為同一品種是危險(xiǎn)的[，36]。實(shí)際上，究竟以多少個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)為閾值判定不同品種，是需要在實(shí)踐中以大量品種作為材料進(jìn)行反復(fù)抽樣研究后統(tǒng)計(jì)確定的。在當(dāng)前情況下，對(duì)“相似”品種結(jié)合農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒別也是十分必要的。

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[5]戴劍，洪德林 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻品種鑒定中的應(yīng)用 金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，202，28（）：45-5

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[8]易紅梅，王鳳格，趙久然，等 玉米品種SSR標(biāo)記毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法與變性AGE 銀染檢測(cè)法的比較研究 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，2（5）：64-67

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[20]程本義，夏俊輝，龔俊義，等 SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法在水稻DNA指紋鑒定中的應(yīng)用 中國(guó)水稻科學(xué)，20，25（6）：672-676

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