NA指紋在水稻品種鑒定中的應用與展望

左示敏　周娜娜　陳宗祥　張亞芳　湯義華　毛從亞　許學宏　許明　許如根　潘學彪

摘要：DNA指紋檢測技術應用于植物新品種鑒定已是必然的發展趨勢，在水稻上與其相關的技術標準仍待完善。本文對DNA指紋檢測中主要涉及的分子標記及特點進行歸納，并綜述了DNA指紋在我國水稻品種鑒定中的應用現狀及存在的問題。提出了構建國家和地方兩級DNA指紋標準的必要性和策略，認為可將利用高密度SN標記構建的品種SN指紋制定為國家標準，而基于核心SSR標記構建的品種SSR指紋可制定為地方標準。討論了兩級DNA指紋標準在品種培育、審定管理、市場監管及品種權保護過程中的應用策略以及仍需研究的問題，以期為建立規范化的“水稻品種鑒定 DNA指紋”檢測方法提供幫助。

關鍵詞：水稻；品種鑒定；DNA指紋；分子標記；標準

中圖分類號： S5037文獻標志碼： A[HK]

文章編號：002-302（204）2-0004-04[HS）][HT9SS]

品種是指人類在一定的生態條件和經濟條件下，根據人類的需要所選育的某種作物的一定群體，它具備相對穩定的遺傳特性，在生物學、形態學及經濟性狀上具有相對一致性，與同一作物的其他群體在特征、特性上有所區別即特異性，在產量、抗性、品質等方面都能符合相應地區的生產發展需要。作物優良品種的選育和推廣是現代農業建設的重要支撐，是確保我國糧食安全的關鍵環節。對植物品種進行DUS（特異性、一致性和穩定性）測試一直是新品種保護的技術基礎和授權的科學依據[2-3]。DUS測試主要以田間種植鑒定為主，即根據品種間的田間表型差異判定新品種是否有別于其他品種[2-3]。由于DUS測試周期長、易受環境影響、工作量大，加上新品種數量越來越多，導致在實踐中無法通過DUS測試確定新品種是否有別于現有的所有品種，以及在違規經營中究竟侵犯了哪個品種，此外鑒定結果也嚴重滯后，影響了執法效率[3]。研究表明，DNA分子標記可應用于品種真實性鑒定、審定監管等各個環節，其具備鑒定效率高、周期短、結果準確等諸多優點[4-8]。在水稻上，迄今尚未形成一個廣適性的品種SSR指紋檢測標準[9-]。本文對DNA指紋在水稻品種鑒定中的應用和發展趨勢進行分析，提出構建國家和省級兩級DNA指紋標準的建議及構建策略，以期為不同領域的研究和管理人員理解DNA指紋并盡快建立標準化的應用規程提供幫助。

[WTHZ]水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標記

SSR標記及其多態性分析方法

SSR（simple sequence repeat）標記即簡單序列重復，一般是由2～4個核苷酸為重復單位（基序，motif）組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，如（AT）n、（GCA）n等，其中n表示重復次數，其在同一物種不同基因型品種間的差異較大，并造成SSR長度多態性[5，]。SSR位點兩端多是保守的單拷貝序列，因此，可用兩側的保守序列開發特異CR引物，并通過CR和凝膠電泳技術，顯示SSR位點在品種/個體間的多態性。由于生物基因組中存在非常豐富的SSR位點、數量龐大，理論上分布于整個基因組的不同位置上，因而，基于SSR位點的分子標記可用于鑒別品種的遺傳多樣性。隨著水稻基因組序列的測序完成，水稻基因組中被發現存在超過8 000個SSR位點，平均每25 kb就存在個SSR位點[2-3]，這為利用SSR標記研究水稻品種間的遺傳多樣性以及品種真偽性提供了豐富的標記基礎。

SSR技術具有操作簡便、效率高、重演性強等特點，現已被廣泛應用于水稻遺傳圖譜構建、重要性狀基因定位和標記輔助育種等眾多領域，也是當前主要農作物品種（如玉米、水稻、大豆）真偽性鑒定中應用最廣泛的分子標記[，4-7]。SSR標記的多態性檢測可采用瓊脂糖凝膠電泳、（變性或非變性）聚丙烯胺凝膠電泳和毛細管電泳熒光檢測法進行[5，7-20]，各方法的優缺點見表。比較而言，毛細管電泳熒光標記檢測方法的分辨率最高[9-20]，理論上可達到 bp，盡管當前的儀器設備和試劑成本較高，但由于該方法可實現自動化以及實現不同批次樣本電泳結果間的直接比較，因此其檢測體系一旦被建立，必將替代上述其他2種電泳分析方法。毛細管電泳熒光檢測技術對CR擴增的特異性要求較高，因此，不能簡單地將常規的CR擴增條件移植至毛細管電泳熒光檢測方法中[9]。目前在玉米上已初步建立了基于毛細管電泳熒光檢測法的品種SSR指紋分析技術[7，9]，但在水稻上，迄今只有篇研究報道[20]，相關分子標記的擴增體系和條件尚有待優化和標準化。

2SN標記及其多態性檢測方法

[CM（24]SN（single[KG3]nucleotide[KG2]polymorphism）是指由單核苷酸變[CM）][FL）]

[FK（W4][HT6H][Z][WTHZ]表水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標記及其多態性分析方法比較[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK5，WK，WK9，WK35W]標記類型標記特點多態性檢測多態性檢測方法優缺點

[BHDG42，WK5，WKZQ2，WK9ZQ0，WK35ZQW]SSR長度多態性，數量較大瓊脂糖凝膠電泳[2]優點：操作簡單、成本低、重復性好、顯色方便，電泳圖譜中的背景干擾少；根據代表性品種擴增條帶可實現不同批次結果間的橫向比較。缺點：分辨率低，難以區分8 bp以內的長度差異；不能給出擴增片段的長度估計值；不易實現自動化

[BHDW]聚丙烯酰胺凝膠電泳優點：分辨率中等，理論上可區分3 bp以上的長度差異；根據代表性品種擴增條帶可實現不同批次結果間的橫向比較。缺點：操作繁瑣、效率低，顯色過程中容易存在背景干擾；不可給出擴增片段的長度估計值；不易實現自動化

[BH]毛細管電泳熒光標記優點：分辨率高，理論上可區分 bp長度差異；可實現自動化；結合標準品種可給出擴增片段長度的估計值；可實現不同批次結果間的直接比較。缺點：對模板質量、CR擴增特異性要求高；儀器及試劑成本較高

[BH]SN單核苷酸多態性，數量巨大，隨機分布芯片雜交檢測優點：直接給出SN位點中的堿基組成，真正意義上的DNA指紋；容易獲得與重要性狀基因緊密連鎖的SN標記，育種利用價值高；自動化和通量化程度極高。缺點：多態性檢測技術要求高，一般實驗室無法開展；試劑成本高[H][BG）F][FK）]

[FL（2K2]

異引起的DNA序列多態性，包括單堿基轉換、顛換、插入及缺失等形式[2-22]。相比于其他DNA標記，SN標記在任一作物群體中的數量、基因組覆蓋度和分布頻率均最高，是研究作物品種遺傳多樣性和真偽性的最理想分子標記。在水稻基因組中，平均每 kb即存在個SN位點，暗示絕大多數基因內均存在至少個SN位點[23-24]。長期以來，對單核苷酸多態性缺乏高效檢測技術一直是限制SN標記應用的最主要原因。近年來，隨著DNA微陣列和芯片雜交技術的快速發展，SN標記在作物種質資源遺傳多樣性研究中的應用已成為現實[23-26]。

基于芯片雜交技術的SN檢測方法最顯著優勢是可確定樣本在各SN位點中的具體堿基組成[23]，因而是真正意義上的DNA指紋，這是上述基于SSR標記多態性分析中無法做到的。另外，張SN芯片上可點陣幾萬甚至幾十萬個標記探針，且同時可對96個或384個樣品進行SN分析，因此是真正意義上的高通量、高效率的品種DNA指紋檢測技術。例如，對于張含有2 000個SN位點的96孔板芯片，次雜交試驗可得出96個樣品中的每個樣品在2 000個SN位點中的基因型，檢測效率極高。在SSR標記毛細管電泳熒光檢測法中，以最新的高通量SSR分析系統（Advanced Analytical公司的Fragment Analyzer系統）為例，該系統一次性可完成0個標記在96個樣本（0×96孔板）或個標記在960個樣本上的基因型分析，如果需要完成96個樣本在2 000個SSR位點中的基因型分析，則需要至少200次獨立反應，耗時長。如果需要增加標記個數，毛細管電泳熒光標記檢測的工作量會相應增加，相反，對于SN芯片，其攜帶的標記數不管多少，均是一次性完成，不需增加額外工作量。SN芯片雜交方法的主要缺點是檢測成本高，且需要在專業化的芯片服務公司中進行，一般實驗室無法開展。

利用SN標記構建品種DNA指紋的最關鍵問題是選擇合適的SN位點，這需要行業內的科學家協作研究，待位點確定后即可在專業化芯片公司中制備和規模化生產SN芯片以及開展后續的應用分析工作[23，27]。在水稻上，美國康奈爾大學McCouch實驗室率先在Affymetrix公司定制了含有44萬個SN標記的SN芯片，并利用其評價了國際水稻微核心種質庫中的44份種質的遺傳多樣性[23]。此外，國內研究者還通過測序技術，對幾千份國內外水稻品種的基因組序列進行了重測序[28]，這為鑒定出更多有用的SN位點提供了豐富的序列基礎。這些研究表明，通過SN芯片構建水稻品種DNA指紋是切實可行的。

[WTHZ]2DNA指紋在水稻品種鑒定中的應用現狀

在水稻品種DNA指紋圖譜研究中，莊杰云等[9]通過58個候選SSR標記和63個代表性水稻品種為材料，確定了用于鑒定我國主栽水稻品種的24對核心SSR標記，并率先制定了“水稻品種鑒定DNA指紋方法”國家農業行業標準（NY/T 433—2007）（以下簡稱舊標準）[29-30]，這是迄今水稻品種DNA指紋研究中最具代表性的一項工作。除此之外，不少學者還分別對不同地區、不同類型的水稻品種或重要育種材料進行了DNA指紋分析。如，肖小余等[0]以四川省主要雜交稻親本為研究對象，從208對SSR引物中篩選出了8對多態性高的SSR標記，并以此構建了四川省26個主要雜交稻親本材料的SSR指紋圖譜。程本義等[3]、陳英華等[32]、楊旭等[33]分別構建了浙江省、東北地區和云貴地區的相關水稻品種（系）的SSR指紋。顏靜宛等[34]和田大剛等[34-35]先后開發并驗證了用于鑒別我國雜交稻品種及其主要親本材料的24對核心SSR標記，并認為可將此24對標記與莊杰云等[9]制定的農業行業標準中的24對標記結合使用，以增加品種鑒定的準確性。目前，農業部網站上已顯示有一套新的“水稻品種鑒定SSR標記法”正待審批[30]，該標準將替代2007年制定的舊標準。相對于舊標準，新標準中的標記數目增加倍，這無疑將大大提高新標準的鑒別力，但究竟是否適用于全國各地的不同水稻品種鑒定仍有待實踐檢驗。作者在利用新標準中的48對SSR標記鑒別江蘇近5年審定的粳稻品種時，發現其中有26個標記在供試品種間沒有多態性，且有2個品種無法采用48對標記進行鑒別，這表明新標準在鑒別局部地區品種上仍有待發展。

總體而言，在水稻品種DNA指紋鑒別上，至今未能形成一個廣適性的標準。究其原因，可能有以下2個方面：一是研究中選用的樣本數少、來源地窄，導致獲得的核心SSR標記的代表性不足，往往只能用于當地品種鑒別，一旦擴大到其他區域或增加品種數量時，便出現核心SSR標記并不核心的現象；二是我國絕大多數水稻品種間的遺傳基礎窄，尤其是不同省內審定的適用于特定生態區內種植的品種[6]，遺傳多樣性更低，這導致基于不同生態區間的品種研發的多態性SSR標記在一些省內審定品種間沒有多態性。

鑒于此，作者認為以SSR標記建立水稻品種DNA指紋檢測的國家標準值得商榷，因為核心SSR標記庫是個動態擴充庫，而不是一成不變的，即會隨著樣本量的不斷增加而需要不斷更換或增加新標記。如果以此標記建立國家標準，可能會因為不同地區需要增加或更換標記，而經常性地反復修訂國家標準。相反，如果利用SSR標記建立地方（或省級）標準，則不會因為某個地方標準的修訂而影響到其他地方標準的使用，影響面小。

3建立國家和省級兩級DNA指紋標準的必要性和策略

3建立“水稻品種高密度SN標記指紋”國家標準的必要性和策略

水稻育種的核心競爭力在于優異育種中間材料的創新上，我國水稻育種在過去幾十年的發展中，先后培育出了大量原創性優異育種材料，為我國水稻不斷增產豐收作出了巨大貢獻[36]。近年來，一些國際種業巨頭不斷增加在我國開展水稻育種的科研投入，同時，國內一些種業企業也主動參與到國外水稻育種中，造成我國水稻育種材料的流失。因此，從參與國際紛爭中可能存在的知識產權保護考慮，我國需要建立一個“水稻品種鑒定DNA指紋”國家標準[，36]。

作為國家標準，必須保證所有品種或重要育種材料的DNA指紋具有“永久唯一性”特征，即不能隨著新品種或樣本量的增加而出現同一品種不同指紋或不同品種相同指紋的現象。解決此問題的唯一策略是，采用足夠多的分子標記構建品種DNA指紋，而不是以少數核心分子標記（如核心SSR標記）進行。當標記數量足夠大時，采用SN標記是唯一可行的辦法，因此，可利用SN標記建立“水稻品種高密度SN標記指紋”國家標準，并將其應用于解決國際間品種知識產權紛爭中以及分子設計育種過程中。

構建水稻品種高密度的SN指紋數據庫具有以下3個優點：（）構建的各品種DNA指紋可做到“永久唯一性”，在品種權保護和權益紛爭時可為育種者提供重要的裁定證據[，36]；（2）隨著標記密度的增高，可將標記與特定基因建立有機聯系，有利于育種工作者結合SN指紋開展分子設計育種，如設計配組方式、制定選擇目標[2，24]；（3）有利于從國家層面上及時了解不同時期或不同地區內育成品種間的遺傳多樣性，為國家適時制定育種策略以豐富品種多樣性、提高品種抗風險能力提供參考[2，24]。

32建立“水稻品種核心SSR標記指紋”地方標準的必要性和策略

盡管構建全國統一標準的品種高密度SN指紋十分必要，但由于其成本高、一般實驗室無法完成檢測分析工作，使得SN指紋檢測技術不適宜在品種參試、審定和市場監管等常規環節中使用。相反，這些環節的有效管理是從源頭上控制我國品種審定及種業市場中的各種違規違法現象的重要措施。因此，為了常規的監督管理，需要建立一個高效、簡便、低成本的水稻品種鑒定DNA指紋檢測標準。

相比于SN標記，SSR標記的檢測工作可在一般實驗室獨立完成、操作簡便，可用于快速鑒定水稻品種（系）的真偽性[5，9，5]。然而，正如前文所述，對于種植地域性較強的水稻，不適宜構建全國統一的SSR指紋檢測標準。但是，可開發適用于地方品種特異性鑒別的核心SSR標記，以建立“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標準，并將其應用于地方品種參試、種子生產銷售中的各種違規違法現象的監管中。

33國家和地方兩級DNA指紋標準的應用策略

由于國家和地方兩級標準間的應用側重點不同，筆者根據各自的特點，提出在品種培育、品種審定、品種權保護和市場監管環節中差別化應用DNA指紋兩級標準的策略（圖），為規范化兩級標準在實踐中的應用提供參考。

[FK（W7][TZSMtif][FK）]

品種培育是種業發展壯大的根本[36]。建議制定國家規程，要求經過各級政府審定或認定的水稻新品種（系）均要在指定機構、采用國家統一標準，構建相應品種（系）的高密度SN指紋，并將品種SN指紋設為獲得新品種權的重要條件。對于培育的重要育種中間材料，育種者可根據自行需要申請構建其SN指紋，以防相應材料的外流或被盜。建立所有審定品種或重要育種中間材料的高密度SN指紋數據庫，有利于為育種工作者提供重要育種材料的遺傳信息（如控制病蟲害抗性、高產優質等性狀的基因位置及供體親本），并根據這些信息選擇配組親本，開展分子設計育種，提高選擇效率[2，24]，實現品種DNA指紋與育種工作間的有機聯系。

品種審定由國家或省級種子管理部門負責，其中的關鍵是遏制品系參試過程中的違規現象。建議各省級種子管理部門均需制定適用于相應省的“水稻品種鑒定——SSR指紋”地方標準，并將其應用于相應省內區試品系真偽性的快速鑒定[5，9，5]。對于通過審定的品種，按國家和地方兩級標準分別構建其DNA指紋，其中國家的SN指紋主要用于品種培育及在侵權違法事件中地方標準不能解決的情況下和國際性知識產權紛爭中使用，地方的SSR指紋主要在種子監管及常規的侵權違規違法事件中使用。

品種權保護可采用國家標準中的SN指紋和地方標準中的SSR指紋同時進行，以確保品種在國內外種子市場及育種利用等不同環節中得到合法保護[，36]。

市場監管主要是保證種子市場中的種子純度和真實性。當前種子市場中普遍存在套牌侵權、以次充好、銷售假劣種子等違規違法現象[，36]。建議將“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標準全程應用于種子市場監管的各個環節中，以快速鑒定種子純度和真偽性，打擊種子市場中相關違規違法現象，確保健康、公平公正的種業市場環境[36]。

[WTHZ]4水稻品種DNA指紋構建及應用中仍需研究的問題

4高密度SN芯片定制中的SN位點篩選

構建品種高密度SN指紋的最重要價值是將其應用于品種培育環節中，要達到此目的的關鍵是，建立SN標記與重要性狀基因間的關聯[24-27]。這要求在定制SN芯片時，盡可能多地將位于重要性狀（抗性、高產、品質等）基因內或與其緊密連鎖的SN位點作為首先位點[24]；另外需要考慮標記的密度，水稻中平均每0 kb左右存在個基因，因此可按照每0 kb至少個標記的密度篩選SN標記。毋庸置疑，篩選合適的、有價值的SN標記是構建品種SN指紋的最重要環節，這需要不同領域學者間合作進行，目前我國已在這一方面啟動了國家級重大研究課題，相信在幾年內SN芯片定會在我國水稻品種SN指紋構建及分子設計育種中得以應用。

42高密度SN指紋數據在品種培育中的應用

傳統育種在親本配組和個體選擇上主要依賴育種者的經驗進行，基本不考慮配組親本或個體的基因型信息；現代分子設計育種則強調根據基因型開展程序化和標準化的商業化育種，要求盡量降低育種者的選擇經驗性[24]。品種高密度SN指紋數據的產生，將為育種者結合基因型信息選擇配組親本及目標個體提供依據，但育種者如何讀懂如此海量數據的SN信息并將其與育種目標及重要基因間建立聯系，將是利用SN指紋數據開展分子設計育種中需要不斷研究的問題[37]。

43判定為不同品種的差異SSR標記位點數

已公布的國家農業行業標準中規定，樣本間差異位點≥2時判定為不同品種、等于時判定為相似品種、等于0時判定為相同品種。由于絕大多數品種內均存在一定的剩余變異，即純是相對的。剩余變異的存在會導致同一品種在不同批次的SSR指紋檢測結果間存在個別或少數位點差異。因此，僅以被檢品種在核心SSR標記上的指紋與數據庫中授權品種的DNA指紋達到高度相似或相同就判定兩者為同一品種是危險的[，36]。實際上，究竟以多少個差異位點數為閾值判定不同品種，是需要在實踐中以大量品種作為材料進行反復抽樣研究后統計確定的。在當前情況下，對“相似”品種結合農藝性狀進行鑒別也是十分必要的。

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品種是指人類在一定的生態條件和經濟條件下，根據人類的需要所選育的某種作物的一定群體，它具備相對穩定的遺傳特性，在生物學、形態學及經濟性狀上具有相對一致性，與同一作物的其他群體在特征、特性上有所區別即特異性，在產量、抗性、品質等方面都能符合相應地區的生產發展需要。作物優良品種的選育和推廣是現代農業建設的重要支撐，是確保我國糧食安全的關鍵環節。對植物品種進行DUS（特異性、一致性和穩定性）測試一直是新品種保護的技術基礎和授權的科學依據[2-3]。DUS測試主要以田間種植鑒定為主，即根據品種間的田間表型差異判定新品種是否有別于其他品種[2-3]。由于DUS測試周期長、易受環境影響、工作量大，加上新品種數量越來越多，導致在實踐中無法通過DUS測試確定新品種是否有別于現有的所有品種，以及在違規經營中究竟侵犯了哪個品種，此外鑒定結果也嚴重滯后，影響了執法效率[3]。研究表明，DNA分子標記可應用于品種真實性鑒定、審定監管等各個環節，其具備鑒定效率高、周期短、結果準確等諸多優點[4-8]。在水稻上，迄今尚未形成一個廣適性的品種SSR指紋檢測標準[9-]。本文對DNA指紋在水稻品種鑒定中的應用和發展趨勢進行分析，提出構建國家和省級兩級DNA指紋標準的建議及構建策略，以期為不同領域的研究和管理人員理解DNA指紋并盡快建立標準化的應用規程提供幫助。

[WTHZ]水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標記

SSR標記及其多態性分析方法

SSR（simple sequence repeat）標記即簡單序列重復，一般是由2～4個核苷酸為重復單位（基序，motif）組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，如（AT）n、（GCA）n等，其中n表示重復次數，其在同一物種不同基因型品種間的差異較大，并造成SSR長度多態性[5，]。SSR位點兩端多是保守的單拷貝序列，因此，可用兩側的保守序列開發特異CR引物，并通過CR和凝膠電泳技術，顯示SSR位點在品種/個體間的多態性。由于生物基因組中存在非常豐富的SSR位點、數量龐大，理論上分布于整個基因組的不同位置上，因而，基于SSR位點的分子標記可用于鑒別品種的遺傳多樣性。隨著水稻基因組序列的測序完成，水稻基因組中被發現存在超過8 000個SSR位點，平均每25 kb就存在個SSR位點[2-3]，這為利用SSR標記研究水稻品種間的遺傳多樣性以及品種真偽性提供了豐富的標記基礎。

SSR技術具有操作簡便、效率高、重演性強等特點，現已被廣泛應用于水稻遺傳圖譜構建、重要性狀基因定位和標記輔助育種等眾多領域，也是當前主要農作物品種（如玉米、水稻、大豆）真偽性鑒定中應用最廣泛的分子標記[，4-7]。SSR標記的多態性檢測可采用瓊脂糖凝膠電泳、（變性或非變性）聚丙烯胺凝膠電泳和毛細管電泳熒光檢測法進行[5，7-20]，各方法的優缺點見表。比較而言，毛細管電泳熒光標記檢測方法的分辨率最高[9-20]，理論上可達到 bp，盡管當前的儀器設備和試劑成本較高，但由于該方法可實現自動化以及實現不同批次樣本電泳結果間的直接比較，因此其檢測體系一旦被建立，必將替代上述其他2種電泳分析方法。毛細管電泳熒光檢測技術對CR擴增的特異性要求較高，因此，不能簡單地將常規的CR擴增條件移植至毛細管電泳熒光檢測方法中[9]。目前在玉米上已初步建立了基于毛細管電泳熒光檢測法的品種SSR指紋分析技術[7，9]，但在水稻上，迄今只有篇研究報道[20]，相關分子標記的擴增體系和條件尚有待優化和標準化。

2SN標記及其多態性檢測方法

[CM（24]SN（single[KG3]nucleotide[KG2]polymorphism）是指由單核苷酸變[CM）][FL）]

[FK（W4][HT6H][Z][WTHZ]表水稻品種鑒定中主要涉及的DNA分子標記及其多態性分析方法比較[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK5，WK，WK9，WK35W]標記類型標記特點多態性檢測多態性檢測方法優缺點

[BHDG42，WK5，WKZQ2，WK9ZQ0，WK35ZQW]SSR長度多態性，數量較大瓊脂糖凝膠電泳[2]優點：操作簡單、成本低、重復性好、顯色方便，電泳圖譜中的背景干擾少；根據代表性品種擴增條帶可實現不同批次結果間的橫向比較。缺點：分辨率低，難以區分8 bp以內的長度差異；不能給出擴增片段的長度估計值；不易實現自動化

[BHDW]聚丙烯酰胺凝膠電泳優點：分辨率中等，理論上可區分3 bp以上的長度差異；根據代表性品種擴增條帶可實現不同批次結果間的橫向比較。缺點：操作繁瑣、效率低，顯色過程中容易存在背景干擾；不可給出擴增片段的長度估計值；不易實現自動化

[BH]毛細管電泳熒光標記優點：分辨率高，理論上可區分 bp長度差異；可實現自動化；結合標準品種可給出擴增片段長度的估計值；可實現不同批次結果間的直接比較。缺點：對模板質量、CR擴增特異性要求高；儀器及試劑成本較高

[BH]SN單核苷酸多態性，數量巨大，隨機分布芯片雜交檢測優點：直接給出SN位點中的堿基組成，真正意義上的DNA指紋；容易獲得與重要性狀基因緊密連鎖的SN標記，育種利用價值高；自動化和通量化程度極高。缺點：多態性檢測技術要求高，一般實驗室無法開展；試劑成本高[H][BG）F][FK）]

[FL（2K2]

異引起的DNA序列多態性，包括單堿基轉換、顛換、插入及缺失等形式[2-22]。相比于其他DNA標記，SN標記在任一作物群體中的數量、基因組覆蓋度和分布頻率均最高，是研究作物品種遺傳多樣性和真偽性的最理想分子標記。在水稻基因組中，平均每 kb即存在個SN位點，暗示絕大多數基因內均存在至少個SN位點[23-24]。長期以來，對單核苷酸多態性缺乏高效檢測技術一直是限制SN標記應用的最主要原因。近年來，隨著DNA微陣列和芯片雜交技術的快速發展，SN標記在作物種質資源遺傳多樣性研究中的應用已成為現實[23-26]。

基于芯片雜交技術的SN檢測方法最顯著優勢是可確定樣本在各SN位點中的具體堿基組成[23]，因而是真正意義上的DNA指紋，這是上述基于SSR標記多態性分析中無法做到的。另外，張SN芯片上可點陣幾萬甚至幾十萬個標記探針，且同時可對96個或384個樣品進行SN分析，因此是真正意義上的高通量、高效率的品種DNA指紋檢測技術。例如，對于張含有2 000個SN位點的96孔板芯片，次雜交試驗可得出96個樣品中的每個樣品在2 000個SN位點中的基因型，檢測效率極高。在SSR標記毛細管電泳熒光檢測法中，以最新的高通量SSR分析系統（Advanced Analytical公司的Fragment Analyzer系統）為例，該系統一次性可完成0個標記在96個樣本（0×96孔板）或個標記在960個樣本上的基因型分析，如果需要完成96個樣本在2 000個SSR位點中的基因型分析，則需要至少200次獨立反應，耗時長。如果需要增加標記個數，毛細管電泳熒光標記檢測的工作量會相應增加，相反，對于SN芯片，其攜帶的標記數不管多少，均是一次性完成，不需增加額外工作量。SN芯片雜交方法的主要缺點是檢測成本高，且需要在專業化的芯片服務公司中進行，一般實驗室無法開展。

利用SN標記構建品種DNA指紋的最關鍵問題是選擇合適的SN位點，這需要行業內的科學家協作研究，待位點確定后即可在專業化芯片公司中制備和規模化生產SN芯片以及開展后續的應用分析工作[23，27]。在水稻上，美國康奈爾大學McCouch實驗室率先在Affymetrix公司定制了含有44萬個SN標記的SN芯片，并利用其評價了國際水稻微核心種質庫中的44份種質的遺傳多樣性[23]。此外，國內研究者還通過測序技術，對幾千份國內外水稻品種的基因組序列進行了重測序[28]，這為鑒定出更多有用的SN位點提供了豐富的序列基礎。這些研究表明，通過SN芯片構建水稻品種DNA指紋是切實可行的。

[WTHZ]2DNA指紋在水稻品種鑒定中的應用現狀

在水稻品種DNA指紋圖譜研究中，莊杰云等[9]通過58個候選SSR標記和63個代表性水稻品種為材料，確定了用于鑒定我國主栽水稻品種的24對核心SSR標記，并率先制定了“水稻品種鑒定DNA指紋方法”國家農業行業標準（NY/T 433—2007）（以下簡稱舊標準）[29-30]，這是迄今水稻品種DNA指紋研究中最具代表性的一項工作。除此之外，不少學者還分別對不同地區、不同類型的水稻品種或重要育種材料進行了DNA指紋分析。如，肖小余等[0]以四川省主要雜交稻親本為研究對象，從208對SSR引物中篩選出了8對多態性高的SSR標記，并以此構建了四川省26個主要雜交稻親本材料的SSR指紋圖譜。程本義等[3]、陳英華等[32]、楊旭等[33]分別構建了浙江省、東北地區和云貴地區的相關水稻品種（系）的SSR指紋。顏靜宛等[34]和田大剛等[34-35]先后開發并驗證了用于鑒別我國雜交稻品種及其主要親本材料的24對核心SSR標記，并認為可將此24對標記與莊杰云等[9]制定的農業行業標準中的24對標記結合使用，以增加品種鑒定的準確性。目前，農業部網站上已顯示有一套新的“水稻品種鑒定SSR標記法”正待審批[30]，該標準將替代2007年制定的舊標準。相對于舊標準，新標準中的標記數目增加倍，這無疑將大大提高新標準的鑒別力，但究竟是否適用于全國各地的不同水稻品種鑒定仍有待實踐檢驗。作者在利用新標準中的48對SSR標記鑒別江蘇近5年審定的粳稻品種時，發現其中有26個標記在供試品種間沒有多態性，且有2個品種無法采用48對標記進行鑒別，這表明新標準在鑒別局部地區品種上仍有待發展。

總體而言，在水稻品種DNA指紋鑒別上，至今未能形成一個廣適性的標準。究其原因，可能有以下2個方面：一是研究中選用的樣本數少、來源地窄，導致獲得的核心SSR標記的代表性不足，往往只能用于當地品種鑒別，一旦擴大到其他區域或增加品種數量時，便出現核心SSR標記并不核心的現象；二是我國絕大多數水稻品種間的遺傳基礎窄，尤其是不同省內審定的適用于特定生態區內種植的品種[6]，遺傳多樣性更低，這導致基于不同生態區間的品種研發的多態性SSR標記在一些省內審定品種間沒有多態性。

鑒于此，作者認為以SSR標記建立水稻品種DNA指紋檢測的國家標準值得商榷，因為核心SSR標記庫是個動態擴充庫，而不是一成不變的，即會隨著樣本量的不斷增加而需要不斷更換或增加新標記。如果以此標記建立國家標準，可能會因為不同地區需要增加或更換標記，而經常性地反復修訂國家標準。相反，如果利用SSR標記建立地方（或省級）標準，則不會因為某個地方標準的修訂而影響到其他地方標準的使用，影響面小。

3建立國家和省級兩級DNA指紋標準的必要性和策略

3建立“水稻品種高密度SN標記指紋”國家標準的必要性和策略

水稻育種的核心競爭力在于優異育種中間材料的創新上，我國水稻育種在過去幾十年的發展中，先后培育出了大量原創性優異育種材料，為我國水稻不斷增產豐收作出了巨大貢獻[36]。近年來，一些國際種業巨頭不斷增加在我國開展水稻育種的科研投入，同時，國內一些種業企業也主動參與到國外水稻育種中，造成我國水稻育種材料的流失。因此，從參與國際紛爭中可能存在的知識產權保護考慮，我國需要建立一個“水稻品種鑒定DNA指紋”國家標準[，36]。

作為國家標準，必須保證所有品種或重要育種材料的DNA指紋具有“永久唯一性”特征，即不能隨著新品種或樣本量的增加而出現同一品種不同指紋或不同品種相同指紋的現象。解決此問題的唯一策略是，采用足夠多的分子標記構建品種DNA指紋，而不是以少數核心分子標記（如核心SSR標記）進行。當標記數量足夠大時，采用SN標記是唯一可行的辦法，因此，可利用SN標記建立“水稻品種高密度SN標記指紋”國家標準，并將其應用于解決國際間品種知識產權紛爭中以及分子設計育種過程中。

構建水稻品種高密度的SN指紋數據庫具有以下3個優點：（）構建的各品種DNA指紋可做到“永久唯一性”，在品種權保護和權益紛爭時可為育種者提供重要的裁定證據[，36]；（2）隨著標記密度的增高，可將標記與特定基因建立有機聯系，有利于育種工作者結合SN指紋開展分子設計育種，如設計配組方式、制定選擇目標[2，24]；（3）有利于從國家層面上及時了解不同時期或不同地區內育成品種間的遺傳多樣性，為國家適時制定育種策略以豐富品種多樣性、提高品種抗風險能力提供參考[2，24]。

32建立“水稻品種核心SSR標記指紋”地方標準的必要性和策略

盡管構建全國統一標準的品種高密度SN指紋十分必要，但由于其成本高、一般實驗室無法完成檢測分析工作，使得SN指紋檢測技術不適宜在品種參試、審定和市場監管等常規環節中使用。相反，這些環節的有效管理是從源頭上控制我國品種審定及種業市場中的各種違規違法現象的重要措施。因此，為了常規的監督管理，需要建立一個高效、簡便、低成本的水稻品種鑒定DNA指紋檢測標準。

相比于SN標記，SSR標記的檢測工作可在一般實驗室獨立完成、操作簡便，可用于快速鑒定水稻品種（系）的真偽性[5，9，5]。然而，正如前文所述，對于種植地域性較強的水稻，不適宜構建全國統一的SSR指紋檢測標準。但是，可開發適用于地方品種特異性鑒別的核心SSR標記，以建立“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標準，并將其應用于地方品種參試、種子生產銷售中的各種違規違法現象的監管中。

33國家和地方兩級DNA指紋標準的應用策略

由于國家和地方兩級標準間的應用側重點不同，筆者根據各自的特點，提出在品種培育、品種審定、品種權保護和市場監管環節中差別化應用DNA指紋兩級標準的策略（圖），為規范化兩級標準在實踐中的應用提供參考。

[FK（W7][TZSMtif][FK）]

品種培育是種業發展壯大的根本[36]。建議制定國家規程，要求經過各級政府審定或認定的水稻新品種（系）均要在指定機構、采用國家統一標準，構建相應品種（系）的高密度SN指紋，并將品種SN指紋設為獲得新品種權的重要條件。對于培育的重要育種中間材料，育種者可根據自行需要申請構建其SN指紋，以防相應材料的外流或被盜。建立所有審定品種或重要育種中間材料的高密度SN指紋數據庫，有利于為育種工作者提供重要育種材料的遺傳信息（如控制病蟲害抗性、高產優質等性狀的基因位置及供體親本），并根據這些信息選擇配組親本，開展分子設計育種，提高選擇效率[2，24]，實現品種DNA指紋與育種工作間的有機聯系。

品種審定由國家或省級種子管理部門負責，其中的關鍵是遏制品系參試過程中的違規現象。建議各省級種子管理部門均需制定適用于相應省的“水稻品種鑒定——SSR指紋”地方標準，并將其應用于相應省內區試品系真偽性的快速鑒定[5，9，5]。對于通過審定的品種，按國家和地方兩級標準分別構建其DNA指紋，其中國家的SN指紋主要用于品種培育及在侵權違法事件中地方標準不能解決的情況下和國際性知識產權紛爭中使用，地方的SSR指紋主要在種子監管及常規的侵權違規違法事件中使用。

品種權保護可采用國家標準中的SN指紋和地方標準中的SSR指紋同時進行，以確保品種在國內外種子市場及育種利用等不同環節中得到合法保護[，36]。

市場監管主要是保證種子市場中的種子純度和真實性。當前種子市場中普遍存在套牌侵權、以次充好、銷售假劣種子等違規違法現象[，36]。建議將“水稻品種鑒定SSR指紋”地方標準全程應用于種子市場監管的各個環節中，以快速鑒定種子純度和真偽性，打擊種子市場中相關違規違法現象，確保健康、公平公正的種業市場環境[36]。

[WTHZ]4水稻品種DNA指紋構建及應用中仍需研究的問題

4高密度SN芯片定制中的SN位點篩選

構建品種高密度SN指紋的最重要價值是將其應用于品種培育環節中，要達到此目的的關鍵是，建立SN標記與重要性狀基因間的關聯[24-27]。這要求在定制SN芯片時，盡可能多地將位于重要性狀（抗性、高產、品質等）基因內或與其緊密連鎖的SN位點作為首先位點[24]；另外需要考慮標記的密度，水稻中平均每0 kb左右存在個基因，因此可按照每0 kb至少個標記的密度篩選SN標記。毋庸置疑，篩選合適的、有價值的SN標記是構建品種SN指紋的最重要環節，這需要不同領域學者間合作進行，目前我國已在這一方面啟動了國家級重大研究課題，相信在幾年內SN芯片定會在我國水稻品種SN指紋構建及分子設計育種中得以應用。

42高密度SN指紋數據在品種培育中的應用

傳統育種在親本配組和個體選擇上主要依賴育種者的經驗進行，基本不考慮配組親本或個體的基因型信息；現代分子設計育種則強調根據基因型開展程序化和標準化的商業化育種，要求盡量降低育種者的選擇經驗性[24]。品種高密度SN指紋數據的產生，將為育種者結合基因型信息選擇配組親本及目標個體提供依據，但育種者如何讀懂如此海量數據的SN信息并將其與育種目標及重要基因間建立聯系，將是利用SN指紋數據開展分子設計育種中需要不斷研究的問題[37]。

43判定為不同品種的差異SSR標記位點數

已公布的國家農業行業標準中規定，樣本間差異位點≥2時判定為不同品種、等于時判定為相似品種、等于0時判定為相同品種。由于絕大多數品種內均存在一定的剩余變異，即純是相對的。剩余變異的存在會導致同一品種在不同批次的SSR指紋檢測結果間存在個別或少數位點差異。因此，僅以被檢品種在核心SSR標記上的指紋與數據庫中授權品種的DNA指紋達到高度相似或相同就判定兩者為同一品種是危險的[，36]。實際上，究竟以多少個差異位點數為閾值判定不同品種，是需要在實踐中以大量品種作為材料進行反復抽樣研究后統計確定的。在當前情況下，對“相似”品種結合農藝性狀進行鑒別也是十分必要的。

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