Livin、VEGF在骨肉瘤組織中的表達及預后的關系

張黎明

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的最常見骨惡性腫瘤，侵襲性強，易發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移，導致患者病情進展迅速，預后差［1］。研究顯示，凋亡抑制蛋白Livin在骨肉瘤等多種惡性腫瘤組織高表達，不僅參與腫瘤的增殖和凋亡進程，而且與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及對化療藥物的敏感性密切相關［2］。然而，關于 Livin及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在骨肉瘤組織表達的相關性及與腫瘤轉(zhuǎn)移、預后的關系目前筆者尚未見明確報道。本研究通過檢測骨肉瘤組織Livin、VEGF的表達及與臨床病理參數(shù)的關系，分析二者表達的相關性，探討其在骨肉瘤轉(zhuǎn)移及預后中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2011年10月至2013年10月經(jīng)手術(shù)切除的骨肉瘤組織蠟塊標本58例，術(shù)前均未接收任何放化療，經(jīng)臨床﹑影像﹑病理確診為骨肉瘤，臨床病理資料完整。其中男32例，女26例;年齡8～46歲，中位年齡19.4歲。Dahlin病理分型:骨母細胞型20例，纖維母細胞型22例，軟骨母細胞型16例;腫瘤部位:股骨20例，脛腓骨18例，肱骨10例，其他部位10例。Enneking臨床分期:ⅠA期0例，ⅠB期4例，ⅡA期11例，ⅡB期28例，Ⅲ期15例;有軟組織浸潤40例，無軟組織浸潤18例;有肺轉(zhuǎn)移48例，無肺轉(zhuǎn)移10例。另選取同期骨軟骨瘤組織標本35例作為對照，其中男19例，女16例;年齡11～49歲，中位年齡22.3 歲。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體購自 Santa Cruz公司。Trizol、RTPCR試劑盒購自美國Promega公司。免疫組化SP試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR:采用 RT-PCR 技術(shù)檢測 Livin、VEGF mRNA表達，Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。取1 μg總RNA用RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進行后續(xù)PCR擴增。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。擴增完畢后取5 μl PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀對條帶進行掃描分析，以目的基因與β-actin灰度值的比值來反映目的基因mRNA表達水平。見表1。

表1 Livin、VEGF、β-actin 引物序列

1.3.2 免疫組織化學SP法:采用免疫組織化學SP法檢測Livin、VEGF蛋白表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。具體步驟如下:用10%甲醛固定標本，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟至水，PBS漂洗5 min×3次，EDTA抗原修復，室溫冷卻以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS漂洗5 min×3次，正常山羊血清室溫封閉15 min，滴加一抗，4℃過夜，PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗，37℃孵育 30 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育5 min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察標本染色情況，對圖像光密度值進行統(tǒng)計分析。

1.4 判定標準 Livin、VEGF陽性判定標準:胞漿內(nèi)檢出淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。每張切片由兩名病理醫(yī)師隨機選取5個有代表性的視野計數(shù)100個細胞，若陽性細胞數(shù)所占比例＞20%即為陽性。根據(jù)其陽性細胞數(shù)所占百分比及染色強度進行評分并求均值。陽性細胞數(shù)所占百分比:1% ～25% 為1分，26% ～50%為2分，51% ～75% 為3分，76% ～100%為4分;染色強度的深淺積分:無染色為0分，弱陽性為1分，強陽性為2分。然后按照陽性細胞數(shù)所占百分比積分×染色強度的深淺積分，1～2為陰性，3～8為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關性比較采用Spearman等級相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達情況 RT-PCR結(jié)果顯示，在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中，Livin mRNA 表達水平分別為(2.98±0.21)、(1.77 ±0.12)，VEGF mRNA 表達水平分別為(3.76 ±0.35)、(1.89 ±0.15)，Livin、VEGF mRNA 在骨肉瘤組織的表達水平顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達情況 ±s

表2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達情況 ±s

注:與骨肉瘤組織比較，*P ＜0.05

類別 Livin mRNA相對表達水平VEGF mRNA相對表達水平骨肉瘤組織(n=58)2.98 ±0.21 3.76 ±0.35骨軟骨瘤組織(n=35) 1.77 ±0.12* 1.89 ±0.15*

2.2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF蛋白的表達情況 免疫組化結(jié)果顯示，Livin、VEGF蛋白主要定位于胞漿中，呈淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中，Livin蛋白陽性表達率分別為60.3%(35/58)、17.1%(6/35)，平均光密度值分別為(0.54±0.03)、(0.05 ±0.01);VEGF 蛋白陽性表達率分別為 81.0%(47/58)、22.9%(8/35)，平均光密度值分別為(0.72 ±0.04)、(0.06 ±0.02)。Livin、VEGF 蛋白在骨肉瘤組織的陽性表達率和表達水平均顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3，圖1。

表3 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF蛋白的表達情況例(%)

圖1 Livin、VEGF在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織的表達(SP×400)

2.3 骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達與臨床病理特征的關系 Livin、VEGF蛋白在骨肉瘤組織的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、Enneking分期無關(P＞0.05)。而與腫瘤軟組織浸潤、肺轉(zhuǎn)移有關(均P＜0.05)，Livin、VEGF在軟組織浸潤組和無浸潤組的陽性表達率分別 72.5%和 38.9%、90.0%和55.6%;Livin、VEGF在肺轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的陽性表達率分別 75.0% 和 40.0%、91.7% 和 50.0%，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。見表4。

表4 Livin、VEGF蛋白表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系例(%)

2.4 骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達的相關性 58例骨肉瘤組織中，Livin、VEGF均陽性表達者24例(41.38%)，Livin陽性表達且VEGF陰性表達者11例(18.97%)，Livin陰性表達且VEGF陽性表達者8例(13.79%)。相關分析顯示，Livin、VEGF表達呈明顯正相關(r=0.822，P=0.001)。見表5。

表5 Livin、VEGF蛋白在骨肉瘤組織表達的相關性 例

2.5 生存分析 對58例骨肉瘤患者追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，35例Livin蛋白表達陽性組3年存活率為42.9%(15/35)，平均生存時間為(29.5 ±5.21)個月，23 例陰性組存活率為69.6%(16/23)，平均生存時間為(42.3±5.52)個月;47例VEGF蛋白表達陽性組3年存活率為38.3%(18/47)，平均生存時間為(27.2 ±5.17)個月，11例表達陰性組存活率為72.7%(8/11)，平均生存時間為(44.8 ±5.45)個月，Livin、VEGF 蛋白表達與患者生存期密切相關(P＜0.05)。

3 討論

骨肉瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是涉及多基因、多步驟參與的復雜過程，包括腫瘤細胞的異常增殖、新生血管形成、細胞外基質(zhì)成分的降解及腫瘤細胞的遷移等。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成員，是具有抗凋亡作用的重要分子。其抗凋亡機制主要有Caspases依賴途徑和非Caspases依賴途徑:Livin可與Caspases-3和Caspases-7結(jié)合抑制其活性，阻斷Caspases信號傳導通路從而產(chǎn)生抗凋亡作用［3］;另外，Livin與TAB1結(jié)合后能夠活化TAK1，進而激活JNK1，通過TAK1/JNK1途徑介導抗凋亡作用。研究顯示，Livin在正常組織細胞不表達或低表達，而在結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤細胞特異性高表達，參與腫瘤細胞的異常增殖，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4，5］。Li等［6］研究發(fā)現(xiàn)Livin在骨肉瘤細胞系中過表達，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Livin表達能夠抑制腫瘤細胞的異常增殖﹑侵襲并增強細胞對化療藥物的敏感性。因此，Livin可作為骨肉瘤的一個潛在治療靶點。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤血管形成中的關鍵因子，其通過自分泌或旁分泌的方式具有增加血管通透性、促進血管內(nèi)皮細胞增殖、血漿蛋白外滲及間充質(zhì)干細胞的浸潤等作用，這為腫瘤組織提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，并為腫瘤細胞侵入脈管系統(tǒng)及遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了良好條件［7］。研究顯示，VEGF在胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織異常高表達，參與腫瘤細胞的抗凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過程［8，9］。Charity 等［10］研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清VEGF水平與預后密切相關，VEFG高表達表明腫瘤新生血管較多，提示患者預后不良。

本研究采用RT-PCR和免疫組化法檢測骨肉瘤組織Livin、VEGF mRNA和蛋白表達情況，結(jié)果顯示，Livin、VEGF在骨肉瘤組織的陽性表達率顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)合Livin、VEGF表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系，我們發(fā)現(xiàn)有軟組織浸潤和肺轉(zhuǎn)移的患者Livin、VEGF陽性表達率顯著高于無浸潤和無轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示 Livin、VEGF的陽性表達與骨肉瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移能力有關。我們推測異常高表達的Livin、VEGF可能通過某種信號機制對惡變細胞的凋亡進程產(chǎn)生抑制作用，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸。此外，Livin、VEGF蛋白陽性患者3年生存率顯著低于陰性患者，提示Livin、VEGF表達陽性的腫瘤細胞增殖能力和侵襲性強、更易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后差。因此，Livin、VEGF可作為判斷骨肉瘤復發(fā)、早期轉(zhuǎn)移及預后的分子標志物。

相關性分析顯示，骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達趨勢一致，這與Chen等［11］在食管癌組織的報道一致，提示二者共表達在腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。謝楚海等［12］研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織Livin表達與腫瘤微血管密度值(MVD)呈正相關，作者認為Livin可能直接或間接促進VEGF的表達及活性，二者共同參與腫瘤新生血管生成。Yan等［13］研究了HeLa細胞或SK-MEL-28細胞中調(diào)控Livin表達的分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激VEGF表達通過mTOR/4E-BP1信號途徑最終導致Livin蛋白表達增加。因此，我們推測骨肉瘤組織Livin、VEGF表達可能存在相互促進作用，確切機制尚待進一步研究。

綜上所述，Livin、VEGF表達與骨肉瘤患者的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，聯(lián)合檢測骨肉瘤組織Livin、VEGF表達水平能夠為臨床診治骨肉瘤及評估患者預后提供重要參考價值。隨著腫瘤生物治療技術(shù)的發(fā)展，采用小干擾 RNA或特異性抑制劑下調(diào) Livin、VEGF的表達有可能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，并改善患者預后，這有望成為預防或治療骨肉瘤的一個新的研究方向。

1 Botter SM，Neri D，F(xiàn)uchs B.Recent advances in osteosarcoma.Curr Opin Pharmacol，2014，16:15-23.

2 Li X，F(xiàn)an S，Li L，et al.RNA interference-mediated knockdown of Livin suppresses cell proliferation and invasion and enhances the chemosensitivity to cisplatin in human osteosarcoma cells.Int J Oncol，2013，43:159-168.

3 Xu M，Xia LP，F(xiàn)an LJ，et al.Livin and caspase-3 expression are negatively correlated in cervical squamous cell cancer.Eur J Gynaecol Oncol，2013，34:152-155.

4 Myung DS，Park YL，Chung CY，et al.Expression of Livin in colorectal cancer and its relationship to tumor cell behavior and prognosis.PLoS One，2013，8:e73262.

5 Ou JM，Ye B，Qiu MK，et al.Knockdown Livin inhibits growth and invasion of gastric cancer cells through blockade of the MAPK pathway in vitro and in vivo.Int J Oncol，2014，44:276-284.

6 Li X，F(xiàn)an S，Li L，et al.RNA interference-mediated knockdown of Livin suppresses cell proliferation and invasion and enhances the chemosensitivity to cisplatin in human osteosarcoma cells.Int J Oncol，2013，43:159-168.

7 Sun B，Nishihira J，Yoshiki T，et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor invasion and metastasis via the Rho-dependent pathway.Clin Cancer Res，2005，11:1050-1058.

8 Maae E，Olsen DA，Steffensen KD，et al.Prognostic impact of placenta growth factor and vascular endothelial growth factor A in patients with breast cancer.Breast Cancer Res Treat，2012，133:257-265.

9 Kwon KA，Kim SH，Oh SY，et al.Clinical significance of preoperative serum vascular endothelial growth factor，in terleukin-6，and C-reactive protein level in colorectal cancer.BMC Cancer，2010，10:203.

10 Charity RM，F(xiàn)oukas AF，Deshmukh NS，et al.Vascular endothelial growth factor expression in osteosarcoma.Clin Orthop Relat Res，2006，448:193-198.

11 Chen L，Ren GS，Li F，et al.Expression of livin and vascular endothelial growth factor in different clinical stages of human esophageal carcinoma.World J Gastroenterol，2008，14:5749-5754.

12 謝楚海，吳波以，趙玉，等.骨肉瘤中凋亡抑制蛋白Livin表達及其與腫瘤微血管密度的關系.實用醫(yī)學雜志，2011，27:1529-1532.

13 Yan B，Kong M，Chen S，et al.VEGF stimulation enhances Livin protein synthesis through mTOR signaling.J Cell Biochem，2010，111:1114-1124.