牛大腸桿菌病的病原學檢疫

谷作霖

(黑龍江省密山市畜牧獸醫局動物檢疫站,黑龍江密山 158300)

牛大腸桿菌病的病原學檢疫

谷作霖

(黑龍江省密山市畜牧獸醫局動物檢疫站,黑龍江密山 158300)

大腸桿菌主要寄居于人和動物的腸道內,在自然界分布廣泛,屬于條件致病菌。大腸桿菌能通過消化道使人類和畜禽發生感染和中毒。對大腸桿菌病的防治和流行病學調查都依賴于對病原的及時準確的檢測和鑒定。

大腸桿菌病;病原學檢疫

1 病料采集和處理

為了分離到病原性大腸桿菌，應于急性期采集病料，可采集糞便、血液、分泌物；病牛各種臟器如心、肝、脾、腎、淋巴結等病料，用選擇性培養基分離培養?？蓪Ψ蛛x培養物進行細菌染色鏡檢檢查。

2 細菌分離

將采集的病料樣品作畫線培養，接種于普通瓊脂平皿，麥康凱培養基、遠藤氏瓊脂培養基、血液瓊脂平皿上，于37℃培養24h。大腸桿菌在普通營養瓊脂培養基上，可形成光滑型菌落（S），直徑2～3mm，表面光滑，微隆起，濕潤，半透明帶淡灰色菌落易分散于鹽水中。也可形成粗糙型菌落（R），菌落較大，干燥，表面粗糙，邊緣不整齊，在生理鹽水中容易發生自凝集。此外，還有一種黏液型菌落，這種型菌落常見于有莢膜的菌株，在培養基中含有糖類或在室溫中放置易出現黏液型菌落。在麥康凱和遠藤氏瓊脂培養基上生長良好，可形成紅色菌落，是由于大腸桿菌能分解乳糖所致。某些大腸桿菌菌株在血液瓊脂平皿上可出現β溶血環。

3 細菌學檢查

挑取上述菌落涂片、染色、鏡檢，如菌體為革蘭氏陰性，卵圓形或桿狀，大小為1～3μm×0.4～0.7μm，單獨或成雙存在，無芽孢，無莢膜，大多數能運動，具周身鞭毛，則可初步確診；多數菌株在適宜培養條件下可以出現菌毛，菌毛是取得營養、傳遞質粒的通道，也是噬菌體接觸的地方，還能使某些動物的紅細胞發生凝集。這種凝集性能有的菌株常因甘露糖存在而不出現，稱為甘露糖敏感株，簡稱為MS株；另一些菌株稱之為甘露糖抵抗株，簡稱為MR株，即有甘露糖時仍照樣凝集。

4 生化特性

大腸桿菌對氧化酶試驗陰性，不利用檸檬酸鹽，通常利用醋酸鹽作為碳原。還原硝酸鹽，產生靛基質，不產生硫化氫。MR試驗陽性，VP試驗陰性，不液化明膠，不分解尿素；所有菌株能分解葡萄糖、甘露醇、產酸產氣，70%～90%菌株分解蔗糖、乳糖、衛矛醇、水楊苷、山梨醇、阿拉伯膠糖、棉籽糖、鼠李糖、麥芽糖、木糖和蕈糖。

5 分離培養物的鑒定

經選擇性培養基（麥康凱、遠藤、伊紅美藍培養基）從病牛體內分離培養獲得的特征性大腸桿菌菌落，未必都是病原菌。所以需對分離的菌落進行生化特性試驗、病原性鑒定（腸毒素測定，黏附素測定，回歸動物試驗）以及最后作血清學定型試驗。

5.1 大腸桿菌熱敏腸毒素（LT）的檢測

（1）熱敏腸毒素的制備：將被檢大腸桿菌接種到1ml的Ca-YE-I培養基，37℃培養18h后，將此1ml培養物加入到盛有15ml同樣培養基的100ml三角瓶中，仍置37℃培養18h后取出，加入1%硫柳汞0.15ml，其硫柳汞的終濃度為萬分之一，冰箱中過夜殺菌，次日以3500轉/min離心20min，取上清液，供熱敏感腸毒素試驗用，此液應新鮮制備，在冰箱中保存不宜超過3d。

（2）熱敏感腸毒素的檢測

A.兔皮膚藍斑試驗。將成年健康家兔的背部剃毛，或在背部剪毛后涂以脫毛劑（硫化鈉8g、淀粉7g，白糖4g，甘油5g，硼砂1g，水75ml混勻）5min后用溫水洗凈，該部即脫毛。將無毛皮膚區分成15mm見方的小格，在小格的中央皮內注射檢測的濾液0.1ml，每一被檢液作一個重復；在鄰近另一方格中央皮內注射未接種細菌的CaYE-I培養基0.lml作為培養基對照；另取加熱（56℃10min）的被檢濾液接種到另一方格，作為毒素熱敏對照。24h后向試驗兔耳靜脈注射1%伊文思藍生理鹽水液4ml，6h后觀察至24h為止。藍斑直徑大于7mm以上者為陽性，培養基對照及毒素熱敏對照，均應為陰性。

B.乳兔口服試驗。用7～9日齡乳兔，每克體重口服被檢熱敏毒素0.05ml（用細、圓頭塑料管插入食道投入），5h后將乳兔麻醉死亡，剖檢，并稱腸道重（X）與剩余體重（Y），當X：Y≥0.085為陽性，因熱敏毒素能引起腸道炎癥、水腫；如X：Y≤0.074為陰性；比值介于0.073～0.084為可疑。

C.兔回腸結扎試驗。取體重2kg以上的健兔，給水不喂食物饑餓2d。以外科手術切開腹壁，自盲腸游離端處的回腸開始，沿向心方向結扎，每結扎8～10cm一段，間隔3～5cm，再結扎8～10cm一段，間隔3～5cm，又結扎8～10cm一段……。向其中一段腸腔注射被檢熱敏腸毒素1ml，向另一段腸腔注射1ml培養基作為對照。注射完后縫合，給飲水不給食物饑餓12h后，將兔撲殺，測結扎腸段內的液體量（ml）與結扎腸道長度（cm）的比，ml：cm＞l者為陽性，培養基對照段的比值應小于1。

5.2 黏附素測定

取回腸前段，經反復沖洗之后，將黏膜制成涂片，用革蘭氏法染色，鏡檢。如觀察到有大量革蘭氏陰性大腸桿菌樣細菌，即為陽性。也可將沖洗的回腸前段，制成切片、染色、鏡檢；如無黏附素的大腸桿菌樣細菌則易被沖掉；具有黏附素的大腸桿菌，一般均為產LT毒素的致病大腸桿菌。

5.3 回歸動物試驗

將分離獲得的大腸桿菌18h肉湯培養物以0.5～1.0ml劑量口服感染未吃初乳的新生牛犢。如病犢發熱，精神委頓，排水樣稀糞，常致突然死亡，即可做出初步診斷；此時從尸體的內臟和組織里都可分離到單一血清型的大腸桿菌純培養。

[1] 李升團，韓光紅.大腸桿菌O157：H7感染的病原學與流行病學[J].解放軍預防醫學雜志，1997，（5）：387-389.

[2] 冉旭華，王密，聞曉波，等.大腸桿菌病病原學檢測方法的研究進展[J].黑龍江八一農墾大學學報，2008，（2）：51-54.

谷作霖（1971—），男，大專，獸醫師，主要從事動物檢疫檢驗工作。