胰腺癌組織COX-2、VEGF、MMP-9的表達及塞來布昔對人胰腺癌BXPC-3細胞VEGF、MMP-9表達的影響

蘇春永 霍華治 楊曉光

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，該病惡性度極高，早期侵襲和轉移率高，病情進展快，預后嚴重不良［1］。因此，從腫瘤過度增殖、侵襲和轉移的分子機制角度尋找有效的阻斷靶點對于胰腺癌的臨床治療具有重要指導意義。環氧合酶-2(COX-2)是花生四烯酸代謝過程中的限速酶之一，在細胞有絲分裂、細胞粘附、疼痛發生發展等病生理過程中發揮重要調控作用。研究表明，胃癌、結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織高表達COX-2，參與腫瘤發生、發展、侵襲和轉移等多個環節，且與患者預后及存活時間高度相關［2］。最新研究發現，選擇性COX-2抑制劑塞來布昔通過抑制惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移發揮明顯的抗腫瘤作用［3，4］。然而，塞來布昔是否通過抑制血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達發揮抗腫瘤作用的報道筆者所見目前尚少。本研究觀察胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9的表達狀況，并通過體外實驗檢測VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達的變化探討塞來布昔的抗腫瘤機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年9月至2011年3月我院手術切除的原發性胰腺導管腺癌組織標本50例，均經病理確診，臨床病理資料及隨訪資料完整。其中男30例，女20例;年齡29～67歲，平均年齡(50±7)歲;病程1～9年，平均(3.2±0.5)年。

1.2 主要試劑 胰腺癌BXPC-3細胞購自上海中科院細胞庫。兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。Trizol、Real Time-PCR試劑盒購自美國Promega公司。免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學SP法:采用免疫組化法檢測胰腺組織COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達水平，參照說明書操作。將手術切除的癌組織及癌旁正常組織置于4%多聚甲醛中固定，依次進行脫蠟、水化、高壓鍋熱修復后加入特異性一抗4℃過夜;加入生物素標記的二抗，室溫孵育1 h;加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的三抗室溫孵育45 min，DAB顯色，蘇木素染色，封片，光鏡觀察。結果判定標準:COX-2、VEGF、MMP-9陽性染色的判定以細胞膜(質)中檢出棕黃色或深棕色顆粒為標準。隨機選取5個有代表性的視野進行觀察并計數200個細胞，若陽性細胞數占同類細胞數的比例＞5%為陽性，≤5%則為陰性。

1.3.2 細胞培養:在37℃、5%CO2孵箱中用含10%小牛血清的DMEM培養基常規培養BXPC-3細胞。將細胞隨機分為對照組和塞來布昔低、中、高劑量組(終濃度分別為 25、50、100 μmol/L)。

1.3.3 Real Time-PCR(qPCR):采用 qPCR 方法檢測胰腺癌BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達水平，參照說明書操作。Gene Bank網站獲取VEGF、MMP-9基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Trizol提取組織總RNA，將2.0 μg總RNA 用于后續的Real Time-PCR反應。PCR擴增完畢后，以GAPDH為內參照基因，目的基因VEGF、MMP-9表達的相對定量值(RQ值)用于統計分析。見表1。

表1 引物序列及擴增產物長度

1.3.4 Western blot:收集并提取細胞總蛋白，BCA 法定量蛋白后進行 SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，特異性一抗4℃孵育過夜，IgG二抗孵育2 h，ECL顯色。采用UVP分析軟件對目的條帶及內參照條帶做灰度值分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用Sperman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9的表達 胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9表達均為陽性，陽性表達率分別為 72.00%(36/50)、78.00%(39/50)、74.00%(37/50)，與癌旁組織 6.00%(3/50)、8.00%(4/50)、6.00%(3/50)的陽性表達率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 胰腺癌組織、癌旁組織COX-2、VEGF、MMP-9表達的比較n=50，例(%)

2.2 COX-2、VEGF、MMP-9 蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 免疫組化結果顯示，COX-2、VEGF、MMP-9在低增殖活性組和高增殖活性組的陽性表達率分別為 38.46%(5/13)、23.08%(3/13)、30.77%(4/13)和 83.78%(31/37)、89.19%(33/37)、86.49%(32/37)，差異有統計學意義(P＜ 0.05);COX-2、VEGF、MMP-9在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽性表達率分別為 45.00%(9/20)、40.00%(8/20)、35.00%(7/20)和 90.00%(27/30)、93.33%(28/30)、96.67%(29/30)，差異有統計學意義(P＜0.05);COX-2、VEGF、MMP-9 在有遠處轉移和無轉移的陽性表達率分別為 90.32%(28/31)、93.55%(29/31)、96.77%(30/31)和 42.11%(8/19)、36.84%(7/19)、31.58%(6/19)，差異有統計學意義(P＜0.05)。COX-2、VEGF、MMP-9 蛋白表達均與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤位置、病理分級無關(P＞0.05)。見表3。

2.3 相關性分析 Sperman相關分析顯示，胰腺癌組織COX-2與 VEGF、MMP-9表達均呈正相關(r=0.597、0.623，P＜0.05)。

表3 COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的關系n=50，例(%)

2.4 COX-2、VEGF、MMP-9 表達與患者預后的關系

通過對50例患者術后隨訪發現，預后＞1年和≤1年的患者COX-2陽性表達率分別為40.00%(6/15)、85.71%(30/35)，平均生存時間為(21.12 ±2.11)個月、(9.24±1.35)個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。預后＞1年和≤1年的患者VEGF陽性表達率為 40.00%(6/15)、94.29%(33/35)，平均生存時間分別為(21.47 ±2.36)個月、(9.68 ±1.34)個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。預后 ＞1年和≤1年的患者 MMP-9陽性表達率為 20.00%(3/15)、97.14%(34/35)，平均生存時間為(22.12 ±2.42)個月、(9.13 ±1.25)個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明COX-2、VEGF、MMP-9表達陰性的患者預后明顯好于COX-2、VEGF、MMP-9表達陽性的患者。

2.5 塞來布昔對 BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響 與對照組比較，塞來布昔處理24 h后，隨著劑量增加VEGF、MMP-9 mRNA表達水平均有不同程度下降，呈劑量依賴性(P＜0.05)。采用50 μmol/L塞來布昔處理細胞觀察不同時間點VEGF、MMP-9 mRNA表達的變化，結果表明隨著時間延長VEGF、MMP-9 mRNA表達水平均有不同程度下降，呈時間依賴性(P＜0.05)。見表4、5。

表4 塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響 ±s

表4 塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響 ±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別VEGF mRNA MMP-9 mRNA對照組1.94 ±0.31 1.76 ±0.25低劑量組 1.43 ±0.24* 1.30 ±0.19*中劑量組 1.05 ±0.16*# 0.89 ±0.14*#高劑量組 0.64±0.11*#△ 0.43±0.07*#△

表5 不同時段塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響 ±s

表5 不同時段塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9 mRNA表達的影響 ±s

注:與24 h比較，*P ＜0.05;與48 h 比較，#P ＜0.05

組別VEGF mRNA 24 h 48 h 72 h MMP-9 mRNA 24 h 48 h 72 h對照組 1.94 ±0.31 1.98 ±0.33 1.95 ±0.30 1.76 ±0.25 1.73 ±0.26 1.75 ±0.28中劑量組 1.05 ±0.16 0.77 ±0.12* 0.58 ±0.08*# 0.89 ±0.14 0.70 ±0.11* 0.51 ±0.07*#

2.6 塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響 塞來布昔處理24 h后，隨著劑量增加VEGF、MMP-9蛋白表達水平均有不同程度下降，呈劑量依賴性(P＜0.05)。采用50 μmol/L塞來布昔處理細胞觀察不同時間點VEGF、MMP-9蛋白表達的變化，結果表明隨著時間延長VEGF、MMP-9蛋白表達水平均有不同程度下降，呈時間依賴性(P＜0.05)。見表6、7。

表6 塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響 ±s

表6 塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響 ±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別 VEGF蛋白 MMP-9蛋白對照組1.72 ±0.27 1.63 ±0.25低劑量組 1.29 ±0.21* 1.17 ±0.19*中劑量組 0.87 ±0.14*# 0.69 ±0.11*#高劑量組 0.50±0.08*#△ 0.38±0.05*#△

表7不同時段塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響 ±s

表7不同時段塞來布昔對BXPC-3細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響 ±s

注:與24 h比較，*P ＜0.05;與48 h 比較，#P ＜0.05

組別 VEGF蛋白24 h 48 h 72 h MMP-9蛋白24 h 48 h 72 h對照組 1.72 ±0.27 1.74 ±0.30 1.75 ±0.35 1.63 ±0.25 1.62 ±0.26 1.65 ±0.25中劑量組 0.87 ±0.14 0.61 ±0.10* 0.42 ±0.07*# 0.69 ±0.11 0.52 ±0.08* 0.39 ±0.06*#

3 討論

COX-2是一種誘導型酶，在正常組織極少表達，而在胃癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、喉癌等惡性腫瘤組織高表達，預示患者預后不良、生存期短。研究顯示，生長因子、炎性因子、缺氧及致癌物質等因素刺激細胞大量表達COX-2，具有誘導細胞惡變、促進腫瘤細胞過度增殖、侵襲和轉移、抑制細胞凋亡等作用［2］。其可能的作用機制:(1)腫瘤細胞PGE2的表達促進了腫瘤細胞的異常增殖，同時抑制機體免疫力，導致腫瘤免疫逃逸;(2)COX-2通過上調抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl的表達抑制血管內皮細胞的凋亡;(3)COX-2能夠促進VEGF的表達及腫瘤新生血管的形成，而VEGF高表達又可正反饋調節COX-2表達，二者對腫瘤血管生成發揮協同促進作用［5］;(4)COX-2能夠誘導惡性腫瘤細胞表達MMPs，增強腫瘤細胞對細胞外基質的降解能力，從而促進腫瘤細胞的侵襲和擴散［6］。

本研究結果顯示，COX-2、VEGF、MMP-9在胰腺癌組織的陽性表達率(分別為72.00%、78.00%、74.00%)顯著高于癌旁組織(分別為6.00%、8.00%、6.00%)，與Guo等［7］在胃癌﹑乳腺癌等組織的研究結果一致;且三者表達與胰腺癌臨床分期、增殖活性、一年期生存率及腫瘤浸潤轉移等臨床病理特征相關(P＜0.05)，而與年齡、性別、發病部位、病理組織分級無關(P＞0.05)，表明COX-2、VEGF、MMP-9過表達可能和胰腺癌的發生及預后密切相關。COX-2、VEGF、MMP-9表達互相調節、協同作用，共同導致腫瘤的過度增殖、侵襲和擴散［8，9］。

塞來布昔是選擇性COX-2抑制劑，屬于非甾體抗炎藥。近年來研究顯示，塞來布昔通過促進細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤新生血管生成等機制發揮抗腫瘤作用，目前已經廣泛應用于結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤的防治中［3，4］。但COX-2抑制劑在胰腺癌組織的作用機制目前尚不清楚。本實驗選取BXPC-3細胞為研究對象，采用RT-QPCR和Western blot檢測塞來布昔對培養的胰腺癌BXPC-3細胞中VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響，結果顯示，塞來布昔能夠顯著抑制BXPC-3細胞中VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平，呈劑量和時間依賴性，提示塞來布昔對腫瘤侵襲轉移具有明顯的抑制作用，這可能是塞來布昔發揮抗腫瘤作用的機制之一。

綜上所述，本研究結果表明胰腺癌組織高表達COX-2、VEGF、MMP-9，且三者表達具有正相關性，提示COX-2、VEGF、MMP-9發揮協同作用，共同參與胰腺癌的發生發展。此外，COX-2、VEGF、MMP-9與胰腺癌臨床分期、增殖活性、淋巴結及遠處轉移狀況及預后密切相關。COX-2可能通過促進VEGF、MMP-9等基因表達增強了胰腺癌細胞的侵襲轉移能力。選擇性COX-2抑制劑塞來昔布能夠顯著抑制胰腺癌BXPC-3細胞中VEGF、MMP-9的表達，從而發揮抗腫瘤作用。

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