人心臟干細胞獲取量的影響因素及其亞群分析

席雷，李彤

(天津醫(yī)科大學三中心臨床學院，泰達國際心血管病醫(yī)院，天津300070)

近年來，人們發(fā)現心肌組織中存在的心臟干細胞(CSCs)能夠分化為心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，具有較高的分化效率［1］。此外，CSCs由多個亞群組成，不同亞群的CSCs對心臟損傷修復有不同的作用。然而，目前關于CSCs分離培養(yǎng)的實驗對象以鼠為主，缺少對人心肌組織CSCs(hCSCs)的研究，且CSCs數量較少，體外培養(yǎng)困難［2］。因此，2013年10月～2014年10月，本研究探討了獲取hCSCs的影響因素，并分析了hCSCs的亞群特征。

1 材料與方法

1.1 材料 組織來源:選取30例先天性心臟病患兒，男17例、女13例，年齡9個月～11歲(4.11±3.31)歲。術前與患者家屬簽訂知情同意書，并保證實驗過程符合倫理要求。在術中體外循環(huán)前，切取右心耳組織50 mg用于分離培養(yǎng)hCSCs。主要儀器及試劑:胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶(worthing公司，美國);抗體干細胞因子受體酪氨酸激酶(c-Kit)、胰島素基因增強蛋白質(Isl-1)(SantaCruz公司，美國);細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司，美國);免疫熒光共聚焦顯微鏡(Leica，美國);流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hCSCs的分離與培養(yǎng) 將右心耳組織置于轉移液中，整個轉運時間小于30 min。去除表面脂肪組織后，將右心房組織剪成體積為1 mm3的碎塊，使用PBS沖洗2次、每次3 min。將組織碎塊置于含有0.05%胰酶以及0.1%Ⅰ型膠原酶的20 mL D-Hank＇s液內，在37℃恒溫振蕩器上低頻振蕩，消化5 min后，通過80目尼龍篩網，重新收集組織塊，置于纖維蛋白包被的培養(yǎng)皿中，加入完全組織培養(yǎng)基0.5 mL，室溫孵育1 h，再加入完全組織培養(yǎng)基1 mL后，放入37℃、5%CO2的孵箱中孵育，3～4 d更換一次培養(yǎng)基。孵育2周后，可見圓亮細胞出現。收集成團的圓亮細胞，用含有EDTA的PBS溶液沖洗2次，加入0.05%胰酶消化5 min后終止消化，將圓亮細胞接種在多聚D賴氨酸包被的孔板中，并在每個孔板中滴加500 μL心肌球培養(yǎng)基。收集心肌球接種至纖維蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)并用于實驗。

1.2.2 免疫熒光共聚焦染色觀察c-Kit+、Isl-1+細胞的表達情況 細胞滴加至纖維蛋白包被的腔室玻片孔中，并以4%多聚甲醛固定。室溫下，固定的細胞以含有10%山羊血清和0.1%Tween PBS溶液封閉 1 h，一抗孵育(c-Kit，1∶500;Isl-1，1∶500)，4 ℃過夜。PBS浸泡2次，每次5 min，吸水紙吸去液體，滴加二抗。使用含有DAPI的中性樹膠封片。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察切片。

1.2.3 流式細胞術分析c-Kit+及Isl-1+細胞的比例 收集生長狀態(tài)良好的hCSCs，用含0.5%BSA的PBS沖洗。將細胞懸液加在EP管中，待測細胞數≥105。在 EP管中分別加入抗體 c-Kit、Isl-1 2 μL，充分混勻，4℃避光孵育30 min，離心棄上清，PBS洗滌后再次離心棄上清。4%多聚甲醛400 μL重懸，移至流式上樣管，上機檢測。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，采用Pearson法分析年齡、性別與hCSCs數量的相關性。P≤0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hCSCs分離培養(yǎng)的影響因素 培養(yǎng)心肌組織塊1周后，可見成纖維細胞從組織塊邊緣爬出;2周后，在成纖維細胞層上出現圓亮細胞附著。每50 mg心肌組織中可獲取(2.31±1.23)×104個hCSCs。經Pearson相關分析發(fā)現，hCSCs數量與年齡呈負相關(r=-0.869，P＜0.01)，與性別無相關性(r=0.027，P=0.87)。

2.2 hCSCs中c-Kit+、Isl-1+細胞所占比例 hCSCs Isl-1、c-Kit均陽性表達。在1×105的數量級中，Isl-1+細胞占(1.21±0.37)%，c-Kit+細胞占(3.28±0.94)%。

3 討論

hCSCs表達胚胎及干細胞相關抗原，然而其數量有限且提取過程繁瑣，進而制約了關于hCSCs的基礎及臨床研究。因此，如何獲取及培養(yǎng)hCSCs是當前研究的焦點。心室、主動脈根部及右室流出道的心肌組織常用于獲取hCSCs。然而，相比其他心肌位置，手術中獲取右心耳組織方便，風險較低;且切除部分組織后對心功能影響不大。通過本實驗，我們發(fā)現右心耳組織中可獲取hCSCs，且形態(tài)良好，擴增穩(wěn)定，因此，右心耳是獲取hCSCs的首選位置。

目前有兩種常用的hCSCs分離培養(yǎng)方法，即組織塊分離培養(yǎng)法和心肌球培養(yǎng)法。本研究采用的方法是后者。雖然有學者提出，心肌球培養(yǎng)法需要特定的心肌球生長培養(yǎng)液以及多種細胞因子，費用昂貴［3］;但對于從幼兒右心耳提取原代hCSCs來講，可較大程度上獲取并保留具有多向分化特性的細胞。

Miyamoto等［4］從鼠心臟組織內成功分離了 c-Kit+細胞，這些細胞在傳代40代后，依然具有干細胞特性并能分化為心肌細胞、平滑肌細胞及內皮細胞。c-Kit+細胞在5-氮雜胞苷作用下分化為心肌細胞［5］，進一步說明c-Kit+細胞是hCSCs的一類亞群。Isl-1+細胞參與心臟第二心區(qū)形成，在對鼠胚胎期細胞系示蹤分析中發(fā)現，在參與胚胎期心臟形成的細胞中，2/3以上的細胞屬Isl-1+［6］。大部分Isl-1+細胞定位于流出道并分化為心肌細胞，表達肌鈣蛋白T及α平滑肌肌動蛋白［7］。本研究結果顯示，hCSCs中c-Kit與Isl-1均陽性表達，以c-Kit+細胞為主。

有研究表明，供體的生理狀態(tài)及組織來源決定了獲取hCSCs的數量［8］。其中年齡是主要影響因素，隨著年齡的增長，不但心肌組織中hCSCs的數量減少，且向心肌細胞分化的能力減弱［8，9］。本研究支持以上文獻。因此，嬰幼兒心肌組織是獲取hCSCs的最佳來源。

應用hCSCs向心肌細胞分化及旁分泌的特點治療小兒心力衰竭成為當前研究方案之一。非心源性干細胞的細胞核的轉分化過程時間較長、效率較低，且獲得的表型不夠明確。hCSCs可直接分化為心臟的組成部分，更適宜治療心力衰竭。最近的一項實驗表明，2億個骨髓間充質干細胞與1百萬個c-Kit+細胞分別植入心肌梗死模型后，其臨床效果相似，而c-Kit+細胞有更強的再生能力。

對hCSCs的研究可豐富干細胞移植治療心血管疾病的方法，并且對解釋心臟的起源與發(fā)育具有極為重要的意義。由于實驗的局限性，本研究僅對hCSCs的分離培養(yǎng)及其與年齡、性別的相關性、亞群比例作出初步分析，在hCSCs分化為心肌細胞的機制等問題上需要進一步的研究。

［1］Kurazumi H，Li TS，Takemoto Y，et al.Haemodynamic unloading increases the survival and affects the differentiation of cardiac stem cells after implantation into an infarcted heart［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2014，45(6):976-982.

［2］Smith AJ，Lewis FC，Aquila I，et al.Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart［J］.Nat Protoc，2014，9(7):1662-1681.

［3］侯紅，呂安林，邢玉潔，等.人心臟干細胞提取技術的研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7(4):1534-1537.

［4］Miyamoto S，Kawaguchi N，Ellison GM，et al.Characterization of long-term cultured c-Kit+cardiac stem cells derived from adult rat hearts［J］.Stem Cells Dev，2010，19(1):105-116.

［5］He JQ，Vu DM，Hunt G，et al.Human cardiac stem cells isolated from atrial appendages stably express c-kit［J］.PLoS One，2011，6(11):e27719.

［6］Engleka KA，Manderfield LJ，Brust RD，et al.Islet1 derivatives in the heart are of both neural crest and second heart field origin［J］.Circ Res，2012，110(7):922-926.

［7］Genead R，Danielsson C，Andersson AB，et al.Islet-1 cells are cardiac progenitors present during the entire lifespan:from the embryonic stage to adulthood［J］.Stem Cells Dev，2010，19(10):1601-1615.

［8］Itzhaki-Alfia A，Leor J，Raanani E，et al.Patient characteristics and cell source determine the number of isolated human cardiac progenitor cells［J］.Circulation，2009，120(25):2559-2566.

［9］Simpson DL，Mishra R，Sharma S，et al.A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts［J］.Circulation，2012，126(11 Suppl 1):S46-S53.