姜黃素對(duì)內(nèi)毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用探討

谷志龍，姜華茂，胡占升(遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州121001)

姜黃素對(duì)內(nèi)毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用探討

谷志龍，姜華茂，胡占升
(遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州121001)

摘要:目的觀察姜黃素對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法60 只SPF級(jí)BALB/C雄性小鼠，隨機(jī)分為A～F組，每組各10只。A組腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，共注射7 d; B組先腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射LPS 5 mg/kg; C組處理同B組，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗體50 μg; D、E、F組分別腹腔注射姜黃素200、150、100 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，劑量5 mg/kg。A組第8天、B～F組腹腔注射LPS后4～6 h，于無(wú)菌條件下取小鼠肺組織和外周血。采用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)血漿LPS水平。取各組小鼠肺組織標(biāo)本行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。用RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠肺組織標(biāo)本TLR4 mRNA表達(dá)。用Western-blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織標(biāo)本TLR4蛋白表達(dá)。取各組小鼠肺組織標(biāo)本行免疫組化染色，檢測(cè)MyD88及NF-κB表達(dá)。結(jié)果

與A組相比，B組小鼠血漿LPS增高(P＜0.01)，肺組織呈ALI表現(xiàn)，且TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表達(dá)上調(diào)(P均＜0.01)。與B組相比，D、E、F組小鼠血漿LPS明顯降低(P均＜0.01)，肺組織病理?yè)p傷程度下降，TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表達(dá)下調(diào)(P均＜0.01)。結(jié)論姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷有保護(hù)作用，其主要機(jī)制可能與姜黃素抑制LPS-TLR4激活MyD88-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞:姜黃素;中藥;急性肺損傷;脂多糖; Toll樣受體4; MyD88蛋白;核因子κB

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.002

急性肺損傷(ALI)主要病理特征是在毛細(xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮廣泛損傷［1］，發(fā)病率及病死率高，目前除對(duì)癥支持治療外，尚無(wú)特效治療手段。炎癥介質(zhì)瀑布樣釋放和ALI發(fā)生有著十分密切關(guān)系，多項(xiàng)研究［2，3］表明脂多糖(LPS)致ALI主要機(jī)制是LPS通過(guò)與Toll樣受體(TLR) 4結(jié)合，激活單核巨噬細(xì)胞，釋放大量炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，介導(dǎo)肺部失控性炎癥反應(yīng)。中藥姜黃素有抑制炎性細(xì)胞活性［4～6］、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤［7～9］等作用。2015 年1～2月，我們觀察了姜黃素對(duì)于LPS誘導(dǎo)小鼠ALI的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/C雄性小鼠(購(gòu)自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司) 60只，體質(zhì)量30～35 g。常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.1.2藥品和試劑盒內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湛江博康海洋生物有限公司。RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司公司。Western blot試劑盒購(gòu)自碧云天公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物制品公司。姜黃素及LPS均購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理將60只BALB/C雄性小鼠隨機(jī)分A～F組，每組10只。A組腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d; B組先腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射LPS，劑量5 mg/kg; C組處理同B組，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗體50 μg; D、E、F組分別腹腔注射200、150、100 mg/kg姜黃素，1次/d，共注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，劑量5 mg/kg。A組第8天、B ～F組腹腔注射LPS后4～6 h，于無(wú)菌條件下取小鼠肺組織和外周血待測(cè)。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.2.1血漿內(nèi)毒素水平分離各組小鼠外周血標(biāo)本的血漿，用血漿細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(動(dòng)態(tài)濁度法)檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2.2肺組織形態(tài)學(xué)觀察將各組小鼠肺組織用4%甲醛固定，經(jīng)浸潤(rùn)、脫水，二甲醛，石蠟包理，連續(xù)切片5張，厚度6 μm，HE染色光鏡下觀察。用Gloor［10］方法行病理?yè)p害評(píng)分。

1.2.2.3肺組織TLR4 mRNA表達(dá)取各組小鼠肺組織標(biāo)本80～100 mg，采用RT-PCR法檢測(cè)其中TLR4 mRNA表達(dá)。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TLR-4上游引物序列: 5'-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3';下游: 3'-TCTGGTTCGGAAAGTCCC-5'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為287 bp;β-actin上游引物序列: 5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3';下游: 3'-CCTTTAGCACGCACACTGTA-5'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為516 bp。反應(yīng)體系: MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、Oligo dT 0.5 μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、Total RNA 1 μL。反應(yīng)條件: 31℃10 min，49.3℃30 min，98℃5 min，4℃5 min。以ATLR4與β-actin的比值表示肺組織TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2.4肺組織TLR4蛋白表達(dá)采用Western blot法。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用Tannon Gis軟件計(jì)算肺組織TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量。以ATLR4和β-actin的比值表示肺組織TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2.5肺組織MyD88和NF-κB表達(dá)采用免疫組化法。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。肺泡壁、肺泡及支氣管鏡下棕色顆粒為陽(yáng)性染色; MyD88和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量通過(guò)Image pro plus 6.0進(jìn)行吸光度值測(cè)定分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以珋x±s表示。組間比較采用單因素方差分析和兩兩比較的LSD檢驗(yàn)。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1造模后一般情況A組全部存活，自潔及攝食水量均正常，反應(yīng)敏捷; B組1只死亡，余小鼠最初活動(dòng)異常，之后蜷縮、抱團(tuán)，反應(yīng)遲鈍，停止攝食水，呼吸頻率加快，失去自潔能力; C、D、E、F組小鼠全部存活，表現(xiàn)同A組。

2.2各組血漿內(nèi)毒素水平及肺組織病理學(xué)表現(xiàn)各組小鼠血漿內(nèi)毒素水平見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與A組比，B、C組血漿內(nèi)毒素水平明顯升高(P均＜0.01) ; D、E、F組血漿內(nèi)毒素水平與B組相比顯著降低(P均＜0.01)，其中D組最低。與A組相比，B組肺間隔明顯增厚并充血，可見(jiàn)肺泡腔水腫及大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。D、E、F組上述病變明顯減輕，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔見(jiàn)少量的紅細(xì)胞及毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張。各組肺組織病理學(xué)評(píng)分見(jiàn)表1。

表1　各組血漿內(nèi)毒素水平比較(EU/mL，±s)

注:與A組相比，#P＜0.01;與B組相比，*P＜0.01。

組別　n　內(nèi)毒素(EU/mL)組織病理學(xué)評(píng)分A組10　7±0.98　1.00±0.52 B組　9　1 160±9.24#　7.89±0.72#C組　10　1 040±9.37#　3.57±0.56#*D組　10　36±1.74#*　3.34±0.48#*E組　10　67±2.34#*　4.74±0.81#*F組　10　85±2.06#*　5.95±0.68#*

2.3肺組織TLR4基因和蛋白表達(dá)各組肺組織TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)量見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，與A組比，B組肺組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P均＜0.01)。C～F組與B組比，TLR4基因及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P均＜0.01)，其中D組最低。

表2　各組肺組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與A組相比，#P＜0.01;與B組相比，*P＜0.01。

組別　n TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量　TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量A組10　0.246 7±0.053 7　0.250 1±0.052 3 B組　9　0.970 3±0.071 4#　0.982 5±0.072 6#C組　10　0.327 4±0.081 5#*　0.359 6±0.072 5#*D組　10　0.303 6±0.061 8#*　0.323 5±0.081 2#*E組　10　0.568 2±0.072 6#*　0.612 5±0.061 4#*F組　10　0.746 2±0.071 4#*　0.762 4±0.025 1#*

2.4肺組織MyD88和NF-kB表達(dá)光鏡下觀察，A組見(jiàn)少量分布的淡棕色顆粒，B組見(jiàn)肺泡壁、支氣管和肺泡大片深棕色顆粒; C組較B組棕色顆粒少、顏色淺; D、E、F組見(jiàn)淺棕色顆粒，分布在肺泡及支氣管上。各組小鼠肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)量見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，與A組相比，B組小鼠肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高(P均＜0.01)。C～F組與B組比肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)明顯下降(P均＜0.01)，D組最低。

表3各組肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)比較(±s)

3　討論

ALI是肺泡上皮及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮的通透性增加所致的非心源性肺水腫。LPS在ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11，12］，和預(yù)后密切相關(guān)。Toll樣受體家族(TLRs)有多種同源物，TLR4是內(nèi)毒素(LPS)受體［13］。感染發(fā)生時(shí)，免疫細(xì)胞識(shí)別侵入機(jī)體的G－細(xì)菌，啟動(dòng)促炎相關(guān)反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄和激活一系列下游分子如NF-κB、MyD88、TNF-α等，最終引起以TNF-α、MyD88、NF-κB等［14，15］為中心的促炎癥因子激活，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑布樣釋放，形成第二次生物損傷效應(yīng)［16］。本研究中B組小鼠腹腔內(nèi)注射LPS后，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)炎性滲出和出血，成功建立了ALI動(dòng)物模型。B組肺組織TLR4 mRNA、TLR4蛋白、MyD88蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制可能與TLR4、MyD88和NF-κB相關(guān)。其機(jī)制可能為L(zhǎng)PS和TLR4結(jié)合后激活下游分子MyD88轉(zhuǎn)錄，將信號(hào)下傳至腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)，活化的TRAF進(jìn)一步激活NF-κB誘導(dǎo)酶，使其磷酸化并遷移至細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-4等釋放，引起相應(yīng)的靶器官損害及臨床癥狀。

本研究結(jié)果顯示，與A組相比，C組小鼠肺組織血漿內(nèi)毒素水平升高，但肺組織HE染色及免疫組化未見(jiàn)明顯病理性ALI改變，肺泡、肺泡壁及支氣管未見(jiàn)棕色顆粒染色，MyD88和NF-kB蛋白表達(dá)明顯下降，提示LPS通過(guò)TLR4受體途徑導(dǎo)致ALI;用姜黃素處理的D、E、F組小鼠肺組織血漿內(nèi)毒素水平明顯低于B組，說(shuō)明姜黃素可以有效降低血漿內(nèi)毒素水平并具有劑量依賴(lài)性，機(jī)制可能與姜黃素增強(qiáng)吞噬細(xì)胞能力，促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌進(jìn)而抑制TNF-α對(duì)抗LPS，但尚不明確確切機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，D、E、F組小鼠肺組織損傷程度、TLR4 mRNA和TLR4蛋白表達(dá)低于B組，并且呈劑量依賴(lài)性變化。機(jī)制可能通過(guò)姜黃素降低血漿內(nèi)毒素水平，從而抑制其與TLR4受體結(jié)合，下調(diào)其下游表達(dá)，從而減輕細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)(MYD88、NF-KB、TNF-α等)對(duì)肺組織的損傷，提示姜黃素具有降低血漿內(nèi)毒素，防治肺損傷作用，可為臨床膿毒血癥引起的ALI提供新的治療方向。

綜上所述，姜黃素預(yù)處理能夠降低LPS誘導(dǎo)的ALI，與劑量相關(guān)，其可能機(jī)制是通過(guò)阻斷、干擾LPS-TLR4-MyD88-NF-kB-TNF-α信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而降低炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)。因此，姜黃素用于治療ALI具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Protective effect of curcumin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice

GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng
(The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of curcumin on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS) in mice and to investigate the mechanism.Methods Sixty BALB/C male mice in SPF grade were randomly divided into groups A，B，C，D，E and F，10 mice in each group.Mice in the groups A，B and C were daily injected with 4 mL normal saline intraperitoneally，once a day and for 7 d; after that，on day 8，mice in the group B were administered with 5 mg/kg LPS for once，and each mouse in the group C was injected with 50 μg TLR-4/MD antibodies 10-12 h before being administered with 5 mg/kg LPS.In the group A，on day 8，the lung tissues and peripheral blood were obtained and in groups B-F，the lung tissues and peripheral blood were obtained 4-6 h after intraperitoneal injection of LPS under the sterile conditions.The peripheral blood plasma was separated to detect the plasma LPS levels.The lung tissue specimen in each group received HE staining，then we observed the pathology changes of the lung tissues.The TLR4 mRNA expression in the lung tissues of each group was detected by RT-PCR，and the TLR4 protein expression in the lung tissues of each group was detected by Western blotting.The specimens of lung tissues received immunohistochemical staining，and then we detected the expression of MyD88 and NF-κB.Results Compared with group A，the plasma LPS was increased (P＜0.01)，lung tissue showed ALI，and TLR4 mRNA and protein expression，MyD88 and NF-κB expression was up-regulated in the group B (all P＜0.01).Compared with group B，the plasma LPS was significantly decreased (all P＜0.01)，the pathology damage of lung tissues declined，TLR4 mRNA and protein expression was down-regulated (all P＜0.01)，MyD88 and NF-κB expression was down-regulated in the groups D，E and F (all P＜0.01).Conclusion Curcu-book=6,ebook=468min has a protective effect on ALI induced by LPS in mice.The mechanism may be related to the inhibition of LPS-TLR4 combination and the activation of MyD88-Nf-kB signal pathway.

Key words:curcumin; acute lung injury; lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; MyD88 protein; nuclear factor-κB

(收稿日期:2015-03-17)

通信作者簡(jiǎn)介:胡占升(1969-)，男，博士，教授、主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槎嗥鞴俟δ芩ソ叩取-mail: lzguchn@ hotmail.com

作者簡(jiǎn)介:第一谷志龍(1984-)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向?yàn)榧毙苑螕p傷和急性呼吸窘迫綜合癥。E-mail: lzguchn@163.com

基金項(xiàng)目:遼寧省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(2008419)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)22-0005-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R563