卡維地洛對肝纖維化模型大鼠肝組織瘦素及瘦素受體表達的影響

劉娜，穆華，梁傳棟，王玉珍，鄭吉敏，張建(河北省人民醫院，石家莊050051)

卡維地洛對肝纖維化模型大鼠肝組織瘦素及瘦素受體表達的影響

劉娜，穆華，梁傳棟，王玉珍，鄭吉敏，張建
(河北省人民醫院，石家莊050051)

摘要:目的探討卡維地洛抑制肝纖維化的效果及機制。方法將36只雄性SD大鼠隨機分為對照組6只、模型組10只、治療1組及治療2組各10只。模型組和治療組采用膽總管結扎法建立大鼠肝纖維化模型。治療1、2組造模成功后48 h開始每天予卡維地洛藥液1 mg/kg分2次灌胃，分別用藥2、4周;對照組及模型組同時灌等量蒸餾水。實驗結束后取各組大鼠肝左葉組織切片，行常規HE染色和Masson三色染色，光鏡下觀察各組肝臟纖維化情況; Western blot法檢測各組肝組織瘦素以及瘦素受體表達; Real-time Q-PCR法檢測瘦素及瘦素受體mRNA。結果HE 及Masson三色染色光鏡下觀察可見，模型組成功建立膽汁淤積性肝纖維化模型，隨著造模時間延長肝纖維化程度逐漸加重。治療1、2組肝臟纖維化程度較模型組減輕，肝臟纖維化分期降低，P＜0.05。治療2組肝纖維化程度與治療1組無統計學差異(P＞0.05)。模型組肝組織瘦素、瘦素受體蛋白及mRNA表達量均較對照組升高(P均＜0.05)，治療1、2組肝組織瘦素、瘦素受體蛋白及mRNA表達量均較模型組降低(P均＜0.05)，兩治療組相比無統計學差異(P ＞0.05)。結論卡維地洛能對肝纖維化有抑制作用;其機制可能為下調瘦素及瘦素受體基因表達。

關鍵詞:肝纖維化;大鼠;卡維地洛;瘦素;可溶性瘦素受體

肝纖維化是各種致病因素引起肝臟實質細胞壞死，細胞外基質異常增多和過度沉積所致。卡維地洛是新一代具有血管擴張作用的非選擇性β受體阻滯劑，兼有α1拮抗作用［1］。研究發現，其可通過交感神經受體阻滯作用直接抑制成纖維細胞的增殖，進而阻止細胞外間質的合成。為探討卡維地洛對肝纖維化的抑制作用及其機制，我們于2014年2月～2015年2月進行了如下研究。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物:清潔級雄性SD大鼠36只(購于河北醫科大學實驗動物中心，醫動字第04057 號)，體質量150～200 g;按清潔級大鼠的要求飼養，自由進食水。主要試劑和藥物:卡維地洛(6.25 mg/片)研碎溶于蒸餾水備用。瘦素抗體和瘦素受體抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。逆轉錄反應體系、SYBR Green Real Master Mix、Trizol試劑盒購自中國北京天根公司; PCR擴增用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2肝纖維化模型制作及干預將36只大鼠隨機分為對照組6只、模型組10只、治療1組及治療2組各10只。模型組和治療1、2組采用膽總管結扎法制作肝纖維化模型［2］。治療1、2組造模成功后48 h開始每天予卡維地洛藥液1 mg/kg分2次灌胃，分別用藥2、4周;對照組及模型組同時灌等量蒸餾水。給藥結束后各組均無菌條件下切開皮膚進入腹腔，取左葉肝組織3塊，各100 mg，備提取RNA和蛋白用;再切取相同部位左葉肝組織5 mm×5 mm ×5 mm，以4%多聚甲醛固定，常規石蠟切片，用于HE染色和Masson染色。

1.3觀察項目及方法

1.3.1肝組織病理學變化常規HE染色和Masson三色染色后于光學顯微鏡下觀察肝組織病理學改變，每張切片隨機取10個視野。根據肝臟膠原纖維增生程度，按肝纖維化分級標準進行分級。0級:肝組織正常，無膠原纖維增生;Ⅰ級:膠原纖維從匯管區或中央靜脈周圍輕度向外延伸;Ⅱ級:膠原纖維延伸明顯，但尚未相互連接包繞整個肝小葉;Ⅲ級:膠原纖維延伸明顯，相互連結，包繞整個肝小葉;Ⅳ級:膠原纖維包繞分割肝小葉，以致正常肝小葉結構破壞，假小葉形成，但以大方形假小葉為主;Ⅴ級:肝小葉結構完全破壞，假小葉形成，大方形假小葉與小圓形假小葉各占50%;Ⅵ級:肝內滿布小圓形假小葉，假小葉內有粗大增生的膠原纖維。

1.3.2肝組織瘦素及瘦素受體蛋白表達提取肝組織總蛋白，用考馬斯亮藍比色法測定瘦素及瘦素受體蛋白含量。以8%的SDS-PAGE凝膠作為分離膠電泳，轉膜，封閉，分別以兔抗人痩素抗體(1∶200)、兔抗人痩素受體抗體(1∶200)和兔抗人β-Actin多克隆抗體(1∶200)作為第一抗體反應;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)作為第二抗體反應。采用ECL發光劑顯影、定影，結果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。密度掃描分析采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對結果進行定量分析，灰度值以積分光密度值(IOD)表示。

1.3.3肝組織瘦素及瘦素受體mRNA表達采用實時熒光定量PCR (Real-time Q-PCR)法。采用TrizoL法提取肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA;瘦素、瘦素受體及內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物參照Genebank基因序列自行設計，由北京賽百盛基因有限公司合成。引物序列:瘦素正向5'-CAATGACATTTCACACACGCAG-3'，反向5'-AGATGGAGGAGGTCTCGCAG-3'，擴增產物長度204 bp。瘦素受體正向5'-GTGTCCTTCCTGACTCCGTAG-3'，反向5'-GTTATTCTCTGGAAAGACTGGCT-3'，擴增產物長度119 bp。GAPDH正向5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，反向5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'，擴增產物長度259 bp。在PE5700實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時定量擴增。SYBR反應體系25 μL。反應條件: 93℃、5 min，1個循環; 93℃、45 s，55℃、1 min，10個循環; 93℃、30 s，55℃、45 s，30個循環。采用實時熒光定量PCR儀自帶軟件計算獲得產物的Ct值。采用相對定量2－△△Ct法計算瘦素、瘦素受體mRNA相對表達量。

1.4統計學方法采用SPSS12.0統計軟件。數據以珋x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用q檢驗。P﹤0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肝組織病理學變化HE及Masson三色染色光鏡下觀察可見，模型組膽汁淤積性肝纖維化模型成功建立，隨著造模時間延長肝纖維化程度逐漸加重。肝臟廣泛纖維結締組織增生，增生的纖維間隔互相連接、包繞、分割，改建原來的肝小葉甚至形成假小葉。肝纖維化分級對照組為0級、模型組為(3.9±0.7)級、治療1組為(2.6±0.7)級、治療2組為(2.4±0.6)級，治療1、2組肝臟纖維化程度較模型組減輕，肝臟纖維化分期降低，P均﹤0.05。治療2組低于治療1組，兩組相比無統計學意義。

2.2瘦素、瘦素受體蛋白、mRNA表達各組肝組織瘦素、瘦素受體蛋白及mRNA表達見表1。由表1可見，模型組肝組織瘦素、瘦素受體蛋白及mRNA表達量均高于對照組(P均＜0.05)，治療1、2組均低于模型組(P均＜0.05) ;治療2組與治療1組相比，差異無統計學意義(P均＞0.05)。

表1　各組肝組織瘦素、瘦素受體蛋白及mRNA表達比較(±s)

注:與模型組相比，*P＜0.05;與對照組相比，#P＜0.05。

組別　n　瘦素蛋白　瘦素受體蛋白　瘦素mRNA瘦素受體mRNA治療1組　10　2.86±0.10 3.24±0.13*2.58±0.09*2.46±0.11*治療2組　10　2.34±0.09*2.37±0.11*1.84±0.12*1.95±0.07*模型組　10　3.24±0.12#4.53±0.15#3.57±0.08#3.95±0.06#對照組6　1.23±0.09 1.42±0.10　1.00±0.08　1.00±0.09

3　討論

瘦素是重要的脂肪因子，其生理作用主要是通過抑制食欲、促進外周的脂肪分解及抑制脂肪的合成來調節體脂肪的穩定［3，4］。此外瘦素還參與肝臟對脂質代謝的調節作用，近年來瘦素在非酒精性脂肪肝、慢性丙型肝炎及肝硬化等肝病中的作用已引起眾多學者的關注［5，6］。研究發現，非酒精性脂肪肝患者血清瘦素水平明顯升高，并與病變程度呈正相關。可溶性瘦素受體是主要的瘦素結合蛋白，影響游離瘦素指數，調節瘦素的生物活性。非酒精性脂肪肝患者血清可溶性瘦素受體水平明顯降低，提示可能與體內存在瘦素抵抗有關。瘦素還可顯著促進肝臟主要纖維生成細胞肝星狀細胞(HSC)的細胞增殖，并抑制HSC的細胞凋亡［7］。

研究證實，交感神經系統過度活化參與了肝臟損傷后修復和纖維化的調節，交感神經系統通過其神經遞質去甲腎上腺素(NE)對HSC增殖和凋亡等細胞行為的調節，影響肝臟纖維化的發生和發展［8］。HSC可以合成和釋放NE，并表達α1、β1、β2等腎上腺素受體。隨著肝纖維化的進展，各腎上腺素受體蛋白及mRNA含量明顯增加［9］。NE還可抑制體外培養HSC的凋亡，并促進其增殖，從而促進肝纖維化的形成;加入NE受體阻滯劑于體外培養的HSC，細胞凋亡明顯增加［10］。動物實驗發現，低兒茶酚胺水平或低交感活性的痩素缺陷性ob/ob小鼠可產生肝纖維化抵抗;給予小鼠肝細胞毒性飲食，NE缺乏者不能出現活化HSC的積累，纖維化形成過程減慢;而補充促腎上腺素釋放物質時，這種現象消失。NE直接作用于HSC，調節并削弱瘦素對HSC的活化［11］。由此可見，瘦素對肝纖維化的調節作用可能需要交感神經系統的參與。

卡維地洛是第三代β阻滯劑，除具有非選擇性阻斷β受體外，還可選擇性地阻斷α1受體，并具有抗氧化、抗增生及抑制細胞凋亡等功能。卡維地洛可能通過其交感神經受體阻滯作用直接抑制成纖維細胞的增殖，進而阻止細胞外間質的合成，減輕心臟間質重塑、預防心力衰竭的發生發展。目前卡維地洛廣泛應用于心血管領域［12］，在肝纖維化方面的研究也屢見報道。本研究模型組肝組織瘦素及瘦素受體蛋白、mRNA表達明顯升高，說明瘦素確實參與了肝纖維化的進程。治療組卡維地洛灌胃后肝纖維化程度減輕，肝纖維化分級明顯改善，肝組織瘦素蛋白及mRNA表達明顯降低。證實卡維地洛可抑制肝纖維化的發生及發展;其機制可能是阻斷交感神經系統的經典神經遞質NE與其特定腎上腺素能受體相結合，進而影響瘦素以及瘦素受體表達。

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Effect of carvedilol on expression of leptin and leptin receptor in liver fibrosis rat models

LIU Na，MU Hua，LIANG Chuan-dong，WANG Yu-zhen，ZHENG Ji-min，ZHANG Jian
(Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China)

Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of carvedilol on inhibition of liver fibrosis.Methods Thirty-six male SD rats were randomly divided into groups: the control group (n=6)，model group (n=10)，the carvedilol treatment group 1 (n=10) and the carvedilol treatment group 2 (n=10).Liver fibrosis rat models were established through common bile duct ligation.After the models were accomplished for 48 hours，the rats of treatment groups 1 and 2 were gavaged with carvedilol 1 mg/kg twice a day for 2 weeks and 4 weeks.The rats in the control group and model group were gavaged with equal quantity distilled water at the same time.After the experiments，liver tissue sections were prepared from left lobe of liver，routine HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the liver fibrosis in each group.The expression of leptin and soluble leptin receptor (sOB-R) in the liver tissues of each group was detected by Western blotting，and the mRNA expression of leptin and leptin receptor was detected with real-time Q-PCR.Results HE and Masson trichrome showed，cholestatic liver fibrosis rat model was successfully established.The degree of liver fibrosis aggravated gradually as the molding time extension.The liver fibrosis in the carvedilol treatment group 1 and group 2 was decreased significantly as compared with that of the model group，and the pathological stage of liver fibrosis reduced significantly as compared with that of the model group (P＜0.05).No statistically significant difference was found between treatment group 1 and treatment group 2 (P＞0.05).The protein and mRNA expression of leptin and sOB-R in the rat liver tissues of the model group was significantly higher than that of the control group (all P＜0.05).The protein and mRNA expression of leptin and sOB-R in the rat liver tissues of the carvedilol treatment groups 1 and 2 was significantly decreased as compared with that of the model group (all P＜0.05)，but the differences between treatment group 1 and treatment group 2 was not statistically significant (P＞0.05).ConclusionCarvedilol can inhibit the process of liver fibrosis，whose mechanism may be the down-regulation of the expression of leptin and sOB-R in the liver tissues.

Key words:hepatic fibrosis; rats; carvedilol; leptin; soluble leptin receptor

(收稿日期:2015-02-15)

作者簡介:第一劉娜(1979-)女，博士，主治醫師，研究方向為慢性肝病的治療。E-mail: 1093961170@ qq.com

文章編號:1002-266X(2015)22-0009-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R575.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.003