SIRT1-shRNA慢病毒表達載體轉染對A549細胞生物學行為的影響

孫碩文，朱之燕，杜瑋，王豪，劉喆(天津醫科大學，天津300070;2天津市胸科醫院)

SIRT1-shRNA慢病毒表達載體轉染對A549細胞生物學行為的影響

孫碩文1，2，朱之燕1，杜瑋1，王豪1，劉喆1
(1天津醫科大學，天津300070;2天津市胸科醫院)

摘要:目的探討SIRT1-shRNA慢病毒表達載體轉染對人非小細胞肺癌A549細胞SIRT1基因表達、黏附能力、遷移能力及E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表達量的影響。方法構建SIRT1-shRNA慢病毒表達載體，并用其轉染A549細胞。對照組轉染277空載體，觀察組轉染277-iSIRT1。用RT-PCR法檢測兩組細胞SIRT1 mRNA表達，用細胞黏附實驗檢測兩組細胞黏附能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，RT-PCR法檢測細胞內E-cadherin、β-catenin mRNA表達，Western blot法檢測細胞內E-cadherin、β-catenin蛋白表達。結果觀察組、對照組A549細胞SIRT1 mRNA分別為0.48±0.26、1.00±0.00(P＜0.05)，黏附細胞數分別為(196.6±9.8)、(125.6±9.8)個(P＜0.05)，細胞相對遷移率分別為65%±2%、100%±0(P＜0.05)，E-cadherin蛋白表達量分別為1.27±0.16、1.00±0.00(P＜0.05)，β-catenin蛋白表達量分別為1.24 ±0.13、1.00±0.00(P＜0.05)。結論SIRT1-shRNA慢病毒表達載體可明顯下調A549細胞SIRT1表達，提高其下游基因E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表達量，增強細胞黏附能力，降低細胞遷移能力。

關鍵詞:非小細胞肺癌; SIRT1-shRNA慢病毒表達載體; SIRT1基因; E-cadherin蛋白;β-catenin蛋白;細胞黏附;細胞遷移

肺癌是全世界發病率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌占所有肺癌的85%，其5年生存率僅有約15%。腫瘤細胞的侵襲和轉移是造成肺癌治療失敗的主要原因。沉默信息調節因子2 (Sir2)是一種高度保守、廣泛存在的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶。已經在哺乳動物中發現有7個Sir2的同源蛋白，分別為SIRT1～SIRT7。其中SIRT1是可使組蛋白和非組蛋白去乙酰化，從而調節細胞增殖、細胞凋亡、能量代謝和腫瘤發生等［1］。大量研究［2～7］顯示，腫瘤組織中的SIRT1蛋白表達明顯上調，SIRT1與腫瘤的發生和轉移密切相關。但是SIRT1調控腫瘤發生發展的機制仍不明確。2013年7月～2014年6月，我們構建了SIRT1-shRNA慢病毒表達載體，并用其轉染非小細胞肺癌A549細胞，觀察其對A549細胞生物學行為的影響，并探討其機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人非小細胞肺癌細胞株A549、Phoenix-293細胞均來自天津醫科大學實驗室。A549細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，37℃、5%CO2培養。Phoenix-293細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養。質粒pSuper.reno.puro (pSRP)和慢病毒包裝系統由本校實驗室保存，限制性內切酶購自NEB，RPMI 1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于Hyclone，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和引物購自Invitrogen，E-cadherin、βcatenin和β-actin抗體分別購自BD Biosciences、Abcam和Millipore，辣根過氧化物羊抗鼠二抗購自Jackson Lab，辣根過氧化物酶羊抗兔二抗購自Bioworld，底物Chemiluminescent HRP Substrate購自Millipore。

1.2實驗方法

1.2.1SIRT1-shRNA慢病毒表達載體的構建及轉染從Sigma網站上提供的shRNA序列中選取1條特異的SIRT1-shRNA靶序列，合成相應的正義和反義DNA序列。以熒光素酶基因的shRNA-iluc作為對照。正義和反義DNA序列退火后形成雙鏈，與pSRP載體連接，轉化入E.coli DH5α細胞中，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，得到轉化子pSRP-iSIRT1。用EcoRⅠ酶切質粒pSRP-iSIRT1，T4 DNA polymerase補平缺口，純化后用XhoⅠ酶切DNA片段，與277載體連接，轉化入E.coli DH5α細胞中，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定后，得到轉化子277-iSIRT1。

待Phoenix-293細胞密度長至80%左右，使慢病毒包裝系統pGCL-GFP，pHelper1.0(gag/pol元件)，pHelper2.0(VSVG元件)和PEI試劑，分別與277空載體、277-iSIRT1質粒混合，轉染Phoenix-293細胞，轉染后24 h，收集含有病毒的Phoenix-293細胞上清液。待A549細胞密度長至60%～70%，棄去培養液。對照組、觀察組分別加入277空載體、277-iSIRT1轉染Phoenix-293細胞的上清液，12 h后更換為正常培養基。顯微鏡下觀察細胞有綠色熒光后，收集總RNA或總蛋白。觀察組和對照組每組6孔進行實驗。

1.2.2SIRT1 mRNA檢測采用PCR法。將轉染SIRT1-shRNA慢病毒表達載體的A549細胞中的培養液棄去，加入Trizoll mL，室溫放置5 min，加入氯仿200 μL，用力震蕩1 min，室溫放置5 min; 4℃下12 000 g離心10 min，吸取上清500 μL至新的1.5 mL離心管;加入－20℃預冷的異丙醇500 μL，混勻后沉淀10 min; 4℃、12 000 g離心10 min，去上清;加入4℃預冷的75%乙醇1 mL，洗滌沉淀; 4℃、12 000 g離心5 min后，棄上清;加入RNase-free的水50 μL，至完全溶解。mRNA逆轉錄:用逆轉錄試劑盒將mRNA轉錄為cDNA。PCR反應: 95℃變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環。SIRT1正向序列: 5'- TGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCC-3'; SIRT1反向序列: 5'-CAACCTGTTCCAGCGTGTCTATGT-3'; GAPDH正向序列: 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'; GAPDH反向序列: 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTIGT-3'。

1.2.3E-cadherin、β-catenin mRNA檢測采用Real-time PCR方法。提取兩組細胞總的RNA并逆轉錄，方法同上。將cDNA稀釋后加入Real-time PCR反應體系中，PCR反應條件為50℃2 min，95 ℃2 min，95℃30 s，60℃1 min，40個循環。E-cadherin正向序列: 5'-ACACTGCCAACTGGCTGGAGATTA-3'; E-cadherin反向序列: 5'-TGATTAGGGCTGTGTACGTGCTGT-3';β-catenin正向序列: 5'-GTTGAGCACCTGTTTGCCTGAAGT-3';β-catenin反向序列: 5'-TCAGGTTTGATCCCATCTTCCGCA-3'; GAPDH正向序列: 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'; GAPDH反向序列: 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。待測基因相對表達量采用2－ΔΔCT法計算。待測基因表達量=2－ΔΔCT。ΔΔCT=待測基因的ΔCT－GAPDH的ΔCT。

1.2.4E-cadherin、β-catenin蛋白檢測采用Western blot方法。將兩組A549細胞培養液棄去，加入100μL蛋白裂解液，將細胞置1.5 mL離心管中，超聲破碎至細胞不再黏稠; 100℃、10 min使蛋白變性。蛋白樣品上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠100 V電泳，直至上樣緩沖液跑到膠外; 200 mA恒流蛋白轉移膜; 5%脫脂牛奶封閉2 h;一抗4℃過夜;二抗室溫孵育2 h后，曝光。內參蛋白為β-actin，使用Quantity One 4.2軟件比較蛋白條帶的灰度值。待測蛋白表達量=待測蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.5細胞黏附能力檢測用纖維連接蛋白(終濃度10 ng/mL)包被處理好的蓋玻片，置于6孔板中4℃過夜;分別取兩組對數生長期細胞5×105接種置于已包被Fibronectin的蓋玻片上，15 min后用冰PBS終止反應，再用PBS輕輕洗一遍;用冰4% PFA固定5～10 min，PBS洗兩遍。用結晶紫染色，四倍顯微鏡下每個孔計數5個視野的黏附細胞數，取其均值進行統計學處理。

1.2.6細胞遷移率測算行細胞劃痕實驗。兩組分別取對數生長期細胞接種到6孔板中;當細胞長至90%左右且為單層貼壁生長時，用10 μL槍頭在單層細胞上垂直劃過;用PBS洗2次后繼續培養，60 h后在倒置顯微鏡下觀察傷口愈合情況，并計算遷移率;細胞遷移率=(原劃痕寬度－現劃痕寬度)/原劃痕寬度。

1.2.7統計學方法采用SPSS11.5統計軟件。計量資料用珋x±s表示。定量數據資料分析使用獨立樣本t檢驗。率的比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1SIRT1 mRNA表達觀察組、對照組的SIRT1 mRNA表達量分別為0.48±0.26、1.00±0.00，P＜0.05。

2.2細胞黏附能力觀察組、對照組的黏附細胞數分別為196.6±9.8、125.6±9.8，P＜0.05。

2.3細胞遷移能力觀察組、對照組的相對遷移率分別為65%±2%、100%±0，P＜0.05。

2.4β-catenin、E-cadherin mRNA及蛋白表達觀察組、對照組E-cadherin mRNA表達量分別為3.63 ±1.48、1.00±0.00;β-catenin mRNA表達量分別為1.53±0.12、1.00±0.00。觀察組明顯高于對照組(P均＜0.05)。觀察組、對照組E-cadherin蛋白表達量分別為1.27±0.16、1.00±0.00;β-catenin蛋白表達量分別為1.24±0.13、1.00±0.00。觀察組明顯高于對照組(P均＜0.05)。

3　討論

SIRT1是一個含有747個氨基酸的蛋白質，包含兩個核定位信號和兩個出核信號調節其氨基酸序列［11］。SIRT1定位于細胞核中，但在神經分化、軸突生長、腫瘤發展和細胞凋亡的過程中穿梭到細胞質中。在細胞核中SIRT1的主要功能為脫乙酰化組蛋白H3和抑制細胞調亡，在細胞質中的具體作用尚不了解，有研究推測SIRT1穿梭到細胞質中可能會使其細胞核內的靶蛋白去乙酰化水平提高，從而改變活性，影響其胞內功能［12］。由于具有這種核漿穿梭的功能，使SIRT1在調控細胞增殖、應激反應及腫瘤發生等方面具有顯著的作用。然而對于SIRT1是促癌基因還是抑癌基因仍然有爭論。一方面，SIRT1可以下調多種抑癌基因(如p53)，促進腫瘤的發生［13］。另一方面，SIRT1可以去乙酰化NF-κB 的RelA/p65亞基，從而抑制轉錄，促進TNF-α誘導的細胞凋亡［14］。

腫瘤轉移是指癌細胞從原發灶脫離向其他組織器官侵襲的過程，其關鍵步驟被認為是上皮細胞間充質轉化(EMT)，即上皮細胞改變其表型和形態特征向間充質細胞轉化的過程。這些變化導致細胞黏附力降低，細胞遷移能力增強，遺傳和表觀遺傳學改變以及上皮細胞標志蛋白E-cadherin和β-catenin表達量降低。本研究中我們構建了SIRT1-shRNA慢病毒表達載體并用其轉染A549細胞，發現A549細胞中SIRT1的表達降低，導致細胞的黏附能力升高，遷移能力下降，E-cadherin和β-catenin的表達量增高，說明降低SIRT1可阻止腫瘤細胞發生EMT改變，從而抑制了非小細胞肺癌的發生與轉移。

E-cadherin是一種重要的細胞黏附分子，在生理條件下調節黏附反應，維持組織結構形態和完整性，并維持細胞極性和參與分化的調節［15］。β-catenin是一種具有多重功能的蛋白，能夠介導細胞間黏附，并能調控基因表達。β-catenin作為黏附復合體的一個亞基，在經典Wnt信號傳導途徑中起到重要作用。當Wnt途徑被激活后，β-catenin將不能被磷酸化降解，胞質中游離的β-catenin升高，進入細胞核，與Tcf/Lef結合并形成復合體調控核內基因的表達，誘導MMP2、MMP9等基因的轉錄促進了腫瘤的侵襲和轉移［16，17］。因而，β-catenin基因被認為是原癌基因。E-cadherin、α-catenin和β-catenin一起組成E-cadherin/catenin復合體，該復合體胞內結構與細胞骨架蛋白結合，胞外結構介導細胞與細胞、細胞與基質的黏附。E-cadherin的喪失或表達下調會誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化，促進了上皮來源腫瘤細胞發生遷移［18］。

下調A549細胞SIRT1表達后雖然β-catenin表達量上升，但是細胞的遷移能力仍然降低，這可能是由于β-catenin被過量的E-cadherin結合并固定于細胞膜上，導致其核內的調控基因表達的功能未能發揮。

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Effect of SIRT1-shRNA lentiviral expression vector transfection on biological behavior of non-small-cell lung cancer A549 cell line

SUN Shuo-wen1，ZHU Zhi-yan，DU Wei，WANG Hao，LIU Zhe
(1 Tianjin Medical University，Tianjin300070，China)

Abstract:Objective To investigate effect of SIRT1-shRNA lentiviral expression vector transfection on the cell adhesion，migration and the expression of E-cadherin and β-catenin in non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cell line.Methods The SIRT1-shRNA lentiviral expression vector was constructed and we used it to transfect the A549 cells.The cells infected with 277 empty vector were used as the control group and the cells infected with 277-iSIRT1 were used as the observation group.The SIRT1 mRNA expression in the two groups was detected by RT-PCR.Cell adhesion status of A549 cells in the two groups was detected by cell adhesion assay，cell migration was detected by wound healing assay，and the protein and mRNA expression levels of E-cadherin andβ-catenin were detected by RT-PCR and Western blotting，respectively.Resultsthe SIRT1 mRNA of A549 cells in the observation group and control group were respectively 0.48±0.26 and 1.00±0.00 (P＜0.05)，the adhesive cells of the observation group and control group were 196.6±9.8 and 125.6 ±9.8，respectively (P＜0.05)，the relative migration rates of the observation group and control group were 0.65±0.02 and 1.00±0.00，respectively (P＜0.05).and the E-cadherin expression levels of the observation group and control group were 1.27±0.16 and 1.00±0.00 (P＜0.05)，and β-catenin expression levels were 1.24±0.13 and 1.00±0.00 (P＜0.05).ConclusionSIRT1-shRNA lentiviral expression vector may significantly down-regulate the expression of SIRT1 in A549 cells，increase the expression levels of E-cadherin andβ-catenin mRNA and protein，enhance the capacity of cell adhesion and reduce the cell migration ability.

Key words:non-small-cell lung cancer (NSCLC) ; SIRT1-shRNA lentiviral expression vector; SIRT1 gene; E-cadherin protein;β-catenin protein; cell adhesion;cell migration

(收稿日期:2015-01-22)

通信作者簡介:朱之燕(1981-)，實驗師，研究方向為腫瘤的表觀遺傳學。E-mail: zhuzhiyan@ tijmu.edu.cn

作者簡介:第一孫碩文(1981-)，女，碩士在讀，主管技師，研究方向為腫瘤的表觀遺傳學。E-mail: karen.81@163.com

基金項目:天津市高等學校科技發展基金計劃項目(20140602)。

文章編號:1002-266X(2015) 22-0012-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.004