原發性肝癌組織中NFKBIA表達變化及意義

王文杰，任剛，亓久德，劉世海，梁軍(萊蕪市人民醫院，山東萊蕪799;青島大學附屬醫院)

原發性肝癌組織中NFKBIA表達變化及意義

王文杰1，2，任剛1，亓久德1，劉世海2，梁軍2
(1萊蕪市人民醫院，山東萊蕪271199;2青島大學附屬醫院)

摘要:目的觀察原發性肝細胞癌(肝癌)組織中NFKBIA基因表達變化，并探討其與肝癌臨床病理參數和預后的關系。方法取74例接受手術治療的肝癌患者的肝癌組織和癌旁正常組織標本，用RT-PCR法檢測NFKBIA mRNA表達。用免疫組化法定性檢測肝癌組織AFP、Ki-67、Connexin-43表達。分析NFKBIA mRNA表達與患者性別、年齡及腫瘤直徑、分化程度、腫瘤包膜完整性、合并肝硬化、合并靜脈癌栓、AFP表達、Ki-67表達、Connexin-43表達的關系。比較NFKBIA陽性、陰性患者的中位生存期。結果肝癌組織、癌旁正常組織NFKBIA mRNA表達量分別為1.13±0.78、2.11±1.57，兩者相比P＜0.05。肝癌組織NFKBIA mRNA表達與腫瘤包膜完整性有關(P＜0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤直徑、分化程度、是否伴靜脈癌栓、是否伴肝硬化、AFP表達、Ki-67表達、Connexin-43表達無關(P均＞0.05)。NFKBIA陰性患者中位生存時間17個月，短于NFKBIA陽性患者的22個月(P＜0.05)。結論肝癌組織NFKBIA基因表達降低。肝癌組織NFKBIA基因表達與肝癌包膜完整性有關。肝癌組織NFKBIA基因表達陰性提示預后不良。

關鍵詞:肝細胞癌; NFKBIA基因;腫瘤包膜完整性

原發性肝癌(肝癌)是目前世界上第5大常見惡性腫瘤，居常見腫瘤死因的第3位［1］。每年大約有超過60萬例新增病例［2］。肝癌手術切除和肝移植治療已經成為肝癌治療的主要手段，但手術后肝內復發和遠處轉移多見。檢測和識別影響肝癌預后的分子標志物，可以為肝癌術后患者的治療方案提供有價值的參考。NF-κB信號通路是肝癌的一條主要信號通路，該信號通路的激活可以導致腫瘤的發生和發展。NFKBIA是NF-κB的抑制因子，可以阻止NF-κB信號通路的激活，但是肝癌組織中NFKBIA的表達情況及其與肝癌臨床病理參數的關系尚不明確［3］。為此，2007年1月～2014年1月，我們進行了如下研究。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2007年1月～2014年1月于青島大學附屬醫院手術切除的74例肝癌患者肝癌組織及癌旁正常組織標本。患者男59例，女15例;年齡33～75歲;腫瘤直徑＜5 cm者38例，≥5 cm 者36例;分化程度:高中分化54例，低分化20例;腫瘤包膜完整35例，腫瘤包膜不完整39例;伴肝硬化53例;伴靜脈癌栓16例。均經病理檢查確診。所有患者術前均未接受放化療及免疫治療。

1.2NFKBIA mRNA檢測方法采用實時定量PCR法和2－△△ct法檢測肝癌組織和癌旁正常組織中NFKBIA mRNA。嚴格按照試劑盒說明書操作。NFKBIA引上游引物5'-CTCCGAGACTTTCGAGGAAATAC-3'，下游引物5'-GCCATTGTAGTTGGTAGCCTTCA-3';β-actin上游引物5'-TCATGGGTGTGAACCATGTGAA-3'，下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。NFKBIA mRNA表達量F=2－△△ct，△△ct=(待測樣品目的基因的ct的平均－待測樣本的內參基因的ct的平均－對照樣品的目的基因的ct的平均－對照樣本的內參基因的ct的平均值)。

1.3AFP、Ki-67和connexin-43檢測方法采用免疫組化法檢測。主要試劑抗AFP、Ki-67和connexin-43鼠單克隆抗體(ab3980、ab15580、ab11370)，均購自美國Abcam公司，即用型ElivisionTM免疫組化二步法染色試劑盒、DAB顯色試劑及其他免疫組化用配套試劑均購自北京中杉公司。按照試劑盒說明書的步驟嚴格進行操作。80℃烤片1 h，經脫蠟液及梯度酒精脫蠟，抗原修復采用微波修復法;置于3% H2O2滅活內源性過氧化物酶;滴加1∶100比例稀釋的一抗，37℃孵育1h;滴加二抗試劑盒試劑，37℃孵育30 min; DAB顯色;各步驟間以PBS沖洗3次，每次3 min;復染核、脫水、透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，說明書所附陽性圖片作為陽性對照。結果判定光鏡下觀察整個切片，每例切片隨機選取5個高倍鏡視野進行結果判定。20%的腫瘤細胞染色強度比周圍的結締組織高則定陽性表達。通過兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法觀察。

1.4隨訪方法對患者進行電話隨訪，時間截止于2014年12月。總生存時間的定義為治療開始至死亡或末次隨訪時間。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。組間比較采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗，等級資料用Spearman等級相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肝癌組織和癌旁正常組織NFKBIA mRNA表達肝癌組織、癌旁正常組織NFKBIA mRNA表達量分別為1.13±0.78、2.11±1.56，兩組相比P＜0.05。

2.2肝癌臨床病理參數與肝癌組織NFKBIA mRNA表達的關系詳見表1。肝癌組織中NFKBIA mRNA表達與腫瘤包膜完整性有關(P＜0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、是否伴靜脈癌栓、是否伴肝硬化、AFP表達、Ki-67表達、Connexin-43表達無關(P均＞0.05)。

2.3肝癌組織NFKBIA mRNA表達與患者術后生存期的關系隨訪截止時死亡56例，存活12例，失訪4例，因其他疾病或意外死亡2例。總生存時間6～72個月。NFKBIA陽性、陰性肝癌患者生存曲線見圖1。NFKBIA陰性患者中位生存時間17個月，NFKBIA陽性患者中位生存時間22個月，P＜0.05。

3　討論

NF-κB由Rel區的蛋白家族組成，包括RelA (p65)、RelB、e-Rel、NF-κB1(p50/p105)及NF-κB2 (p52/p100)。至今，NF-κB信號通路在炎癥反應、免疫應答及腫瘤發生發展中的功能及作用機制仍是研究熱點。NF-κB信號轉導途徑可通過多種途徑抑制細胞凋亡，與Bcl-2家族、IAPs家族、JNK、TRAF家族、FLIP、Gadd45b、A20、MnSOD等分子的調控密切相關［4］;體內、外實驗均證明在腫瘤發生過程中NF-κB起著重要作用［5］。

NFKBIA基因位于人類的染色體14q13，包含有三個區域:一個含氮終端，包含信號依賴的調節蛋白降解的磷酸化位點;一個錨蛋白重復序列;一個調節基礎降解的碳末端PEST區域。外顯子1編碼氮末端，這個區域包含的絲氨酸殘基是磷酸化的重要位點;錨蛋白重復序列位于外顯子2～5;外顯子6為碳末端PEST區域。NFKBIA是調控轉錄因子NF-κB進出細胞核的抑制劑。NFKBIA蛋白包含能與NF-κB蛋白結合的重復錨蛋白為特征。NFKBIA蛋白上Lys-21和(或) Lys-22被磷酸化后的位點特異性泛素化，是激活NF-κB的必要步驟。NFKBIA 與p65/p50二聚體結合后，能夠覆蓋NF-κB的核定位信號，促使NF-κB在細胞內出現錯誤定位，無法到達細胞核，從而使p65/p50在胞質中保持靜息態。當受到外界因子刺激時，NFKBIA發生磷酸化，與p65/p50解離，使NF-κB的核定位信號暴露而活化。隨后，p65/p50二聚體進入細胞核與相應基因的啟動子區結合，啟動相應基因的的表達［6］。研究發現，在多數正常細胞中NF-κB是處于靜息狀態的，但是在腫瘤細胞中NF-κB可能持續處于激活狀態，持續激活的NF-κB可能調節多種致癌基因，并使多種致癌基因處在持續激活狀態，促使致癌基因不斷表達，致使癌組織發生、進展及轉移［7］。

研究發現，NFKBIA在很多惡性腫瘤中都存在著異常表達，并認為NFKBIA的低表達是惡性腫瘤預后差的一個危險因素。Bredel等［10］報道約25%的惡性膠質瘤組織中存在NFKBIA表達缺失。在NFKBIA缺失的細胞中，如果恢復NFKBIA的表達，則腫瘤的惡性程度降低，對化療耐藥性降低。Masashi等［11］發現肺腺癌組織NFKBIA表達陰性。Sanjmyatav等［12］研究發現有轉移的腎透明細胞癌組織中NFKBIA陽性表達率比正常組織低1/4。食管癌組織中NFKBIA亦為低表達［8］。本研究結果顯示，肝癌組織中NFKBIA的表達水平明顯低于肝臟正常組織，與上述研究結果一致。

本研究結果顯示，肝癌組織NFKBIA表達與AFP、ki-67和connexim-43表達無關，生存分析發現，NFKBIA陽性者較陰性者生存時間長，考慮與NFKBIA參與抑制肝癌細胞內的NF-κB信號通路有關。在肝炎、肝纖維化、肝癌中，NF-κB信號轉導通路都起著重要作用。肝細胞中NF-κB持續異常激活，將導致膽汁淤積性肝炎和肝癌發生。阻斷NF-κB信號轉導通路會降低肝臟從慢性炎癥發展為肝癌可能性。Elsharkawy等［9］通過阻止異常通路激活和清除相關產物等途徑，使肝臟中NF-κB維持在正常生理水平，防止發展為肝癌。同時NFKBIA也參與腫瘤細胞內其他信號通路。Chang等［9］研究發現，NFKBIA可以抑制TGF-β1介導的細胞增殖，而NFKBIA的這種抑制作用與其調控NF-κB無關。研究發現，胞質內NFKBIA非錨蛋白區的C端可與p53的脯氨酸富含區發生相互作用形成p53·NFKBIA復合體，而且這個過程是可逆的，一旦有凋亡、DNA損傷、缺氧及TGF-β1調控的生長抑制作用等情況出現時，胞質中的p53·NFKBIA復合體可以迅速分離，游離的p53可進入到細胞核內發揮相應作用［10］。

本研究結果顯示，肝癌組織NFKBIA表達的下調與肝癌包膜的完整性有關。研究已證實，肝癌包膜的形成是肝癌的腫瘤結節和正常肝組織相互作用的結果，肝癌包膜由肝臟的間充質細胞構成，而不是由肝癌細胞構成，完整的肝癌包膜可以阻止腫瘤細胞向正常肝組織的浸潤，因此肝癌包膜的完整性與肝癌預后密切相關［11］。肝癌包膜越完整，其細胞分化程度就越高，血供越不豐富，側支循環也越少［12］。包膜完整者接受肝癌切除術、肝移植手術或經導管化療栓塞治療后，容易取得理想的療效［13］。這可以為臨床醫師選擇合理的治療方案提供參考。當然，肝癌的發生是一個多因素參與、多途徑形成的復雜病理發展過程。NFKBIA在肝癌發生和發展中的作用也同其他信號通路發生聯系［14］。正常情況下，大部分信號通路都是正常控制著肝細胞的自我更新和生理預防肝組織急性損傷，然而，當異常持續激活這些信號通路，正常肝細胞可能被轉化為肝癌細胞［15］。

總之，NFKBIA的表達與肝癌的發生及惡性生長行為相關，提示肝癌的不良預后，且其可能作為肝癌的標志物，為肝癌靶向治療提供新的目標基因。

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Expression changes of NFKBIA in hepatocellular carcinoma and its significance

WANG Wen-jie1，REN Gang，QI Jiu-de，LIU Shi-hai，LIANG Jun
(1 Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271199，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression changes of NFKBIA in the primary hepatocellular carcinoma (PHC) tissues and its relationships with the clinicopathological parameters and prognosis.MethodsThe expression of NFKBIA mRNA in the cancerous tissues and adjacent normal tissues from 74 patients with liver cancer receiving the surgeries was detected by RT-PCR.The expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 in the liver cancer tissues was qualitatively detected by immunohistochemistry.The associations of NFKBIA expression levels with gender，age，diameter of the tumor，differentiation，tumor envelop completeness，liver cirrhosis，tumor thrombus and the expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 were analyzed.Mean survival time (MST) was compared between patients with positive NFKBIA and patients with negative NFKBIA.Results The expression of NFKBIA in the cancer tissues (1.13±0.78) was significantly lower than that in the adjacent normal tissues (2.11±1.56) (P＜0.05).The expression of NFKBIA mRNA in the liver cancer tissues was related with the tumor envelop completeness (P＜0.05)，and was not related with gender，age，diameter，differentiation，tumor thrombus，liver cirrhosis and the expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 (all P＞0.05).The MST of patients with negative NFKFIA expression (17 months) was shorter than that of patients with positive NFKBIA expression (22 months)，(P＜0.05).ConclusionThe expression of NFKBIA decreases in the liver cancer tissues，which may be closely related to tumor envelop completeness.The negative NFKBIA expression predicts the poor prognosis of patients with PHC.

Key words:hepatocellular carcinoma，NFKBIA gene;tumor envelop completeness

(收稿日期:2015-05-10)

通信作者簡介:梁軍(1959-)，男，博士生導師，主任醫師，研究方向為腫瘤綜合治療。E-mail: liangjun818@126.com

作者簡介:第一王文杰(1982-)，男，碩士研究生，研究方向為腫瘤綜合治療。E-mail: wangdao@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81372632)。

文章編號:1002-266X(2015) 22-0016-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.005