腎積水患者血清、腎組織Ⅲ型膠原表達與腎纖維化程度關系的探討

張亮，劉玉強，李遠，張磊，邵光峰，馬敏(山東大學第二醫院，濟南500;山東大學第二醫院; 山東大學齊魯醫院;浙江省金華市中心醫院)

腎積水患者血清、腎組織Ⅲ型膠原表達與腎纖維化程度關系的探討

張亮1，劉玉強2，李遠3，張磊2，邵光峰2，馬敏4
(1山東大學第二醫院，濟南250033;2山東大學第二醫院; 3山東大學齊魯醫院;4浙江省金華市中心醫院)

摘要:目的觀察腎積水患者血清、腎組織Ⅲ型膠原表達變化，探討其與腎纖維化程度的關系。方法選擇輕、中、重度腎積水患者各10例，分別為輕、中、重度腎積水組;選擇10例無腎積水的腎癌或腎外傷患者為對照組。采用放射免疫法檢測各組血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)。手術時取各組患者腎組織(對照組取正常腎組織)用免疫組化SP法檢測腎組織Ⅲ型膠原表達，以IOD值表示。HE染色后光鏡下觀察，計算病變腎小管腎間質(包括腎小管萎縮、腎間質炎癥細胞浸潤、腎間質纖維化、血管硬化)占腎小管和腎間質的體積比率(簡稱病變腎小管腎間質比率)。結果四組患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原IOD值、病變腎小管腎間質比率均為重度腎積水組高于中度腎積水組、中度腎積水組高于輕度腎積水組、輕度腎積水組高于對照組，P均＜0.05。輕、中、重度腎積水患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達變化與病變腎小管腎間質比率呈正相關(r=0.749、0.763、0.896，P均＜0.05)。結論腎積水患者血清、腎組織Ⅲ型膠原表達隨腎積水嚴重程度加重而增多，Ⅲ型膠原表達異常參與了腎積水所致腎組織纖維化的形成。血清PCⅢ、PⅢNP水平與腎積水所致腎間質病變纖維化程度相關。

關鍵詞:腎積水;腎纖維化;Ⅲ型膠原;亞型膠原

腎積水是泌尿外科常見病癥，又稱梗阻性腎病，最終導致腎實質纖維化、腎臟萎縮［1］。腎活檢是判斷腎組織纖維化的金指標，但其操作復雜且有一定的風險性，因此尋找相關的實驗室指標具有重要意義。2009年1月～2009年12月，我們檢測了腎積水患者血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)水平變化及腎組織Ⅲ型膠原表達水平，并分析其與梗阻性腎病患者腎纖維化程度的相關性?，F報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇輕度腎積水患者10例為輕度腎積水組，其中男6例、女4例，年齡19～48歲。中度腎積水患者10例為中度腎積水組，其中男5例、女5例，年齡21～44歲。重度腎積水患者10例為重度腎積水組，其中男4例、女6例，年齡21～73歲。均根據B超檢查結果確診。無腎積水患者10例為對照組，其中腎透明細胞癌患者8例、腎外傷2例，男7例、女3例，年齡26～65歲。各組患者入院查體肝炎病毒血清標志物均無異常，肝功能均正常。所有患者肝、膽、胰、脾B超無明顯異常，胸片心、肺無明顯異常。既往無其他臟器的良、惡性腫瘤史。近期無外傷或手術史。無腎外臟器纖維化。各組年齡、性別差異無統計學意義。

1.2血清PCⅢ及PⅢNP檢測四組患者均于入院查體時由肘靜脈處抽取外周靜脈血3 mL，室溫下靜置8 h，4℃、2 500 r/min離心15 min，離心半徑5 cm。留上層血清置－20℃冰箱保存待測。采用放射免疫法檢測血清PCⅢ及PⅢNP。PCⅢ放射免疫試劑盒購自上海海軍醫學研究所生物技術中心。P ⅢNP放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術研究所。操作按試劑盒說明書進行。正常參考值血清PCⅢ＜120 ng/mL，PⅢNP＜120 μg/mL。

1.3腎組織Ⅲ型膠原表達檢測輕度、中度積水組腎組織標本系腎切開取石術、經皮腎鏡碎石術、輸尿管腫瘤根治術或腎盂輸尿管成形術中取得，重度腎積水組腎組織標本系經腎切除術中留取的殘存腎皮質;對照組腎癌患者腎組織標本系腎癌根治術中需留取癌旁5 cm以外的正常腎組織，腎外傷患者腎組織系行腎切除術時留取的正常腎組織。所有腎組織標本用甲醛固定做成蠟塊待用。取上述蠟塊常規切片并行免疫組化SP染色，操作按試劑盒說明書進行。每張切片在腎小管或腎間質隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，用OlympusBX500圖像分析儀、HPIAS21000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統進行分析，測定積分光密度(IOD)值。

1.4腎組織纖維化程度檢測取上述腎組織蠟塊，常規切片并行HE染色，采用10×10網格多能目鏡測試系統進行形態測量，按文獻采用點計數法［3］，計算病變腎小管腎間質(包括腎小管萎縮、腎間質炎癥細胞浸潤、腎間質纖維化、血管硬化)占腎小管和腎間質的體積比率(以下簡稱病變腎小管腎間質比率)。

1.5統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。四組血清PCⅢ、PⅢNP水平及Ⅲ型膠原積分光密度值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，血清PCⅢ、PⅢNP水平及Ⅲ型膠原積分光密度值組間兩兩比較采用LSD t檢驗;病變腎小管腎間質比率比較采用率的χ2檢驗;血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達變化與病變腎小管腎間質比率的關系采用直線回歸法行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達四組血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達見表1。由表1可見，四組患者清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原IOD值重度腎積水組高于中度腎積水組、中度腎積水組高于輕度腎積水組、輕度腎積水組高于對照組，P均＜0.05。

表1　四組患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達比較(±s)

注:與對照組相比，*P＜0.05;與輕度腎積水組相比，#P＜0.05;與中度腎積水組相比，ΔP＜0.05

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2.2腎組織纖維化程度對照組腎實質組織HE染色可見腎小管管腔無擴張，腎間質無增寬，間質內纖維細胞少而且排列有序。輕、中、重度腎積水組腎實質組織HE染色可見腎組織水腫，腎間質充填著排列無序的明顯增多的纖維細胞，并有炎細胞浸潤，腎小管管腔擴張明顯。輕度積水組、中度積水組、重度腎積水組和對照組病變腎小管腎間質比率分別為10.80%±3.74%、25.12%±8.60%、40.20%± 13.50%、2.00%±0.53%。腎組織病變腎小管腎間質比率重度腎積水組高于中度腎積水組、中度腎積水組高于輕度腎積水組、輕度腎積水組高于對照組，P均＜0.05。

2.3血清PCⅢ、PⅢNP水平及腎組織Ⅲ型膠原表達與腎組織纖維化程度的相關性輕、中、重度腎積水患者血清PCⅢ、PⅢNP水平、腎組織Ⅲ型膠原表達變化與病變腎小管腎間質比率呈正相關(r=0.749、0.763、0.896，P均＜0.05)

3　討論

腎組織纖維化的本質是腎臟微環境改變導致各種正常及異常細胞外基質(ECM)在腎小球及腎間質過度堆積，導致腎組織正常結構破壞、有效腎單位毀損和腎功能進行性下降［4～6］。在間質沉積的ECM的主要成分是Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白及層粘連蛋白［7］。Atul等［8］研究兔單側輸尿管結扎所致腎小管腎間質纖維化模型，發現梗阻后第7天和第16天，腎間質Ⅰ型和Ⅲ型膠原明顯增加。其他研究也表明多種腎臟疾病所致腎纖維化患者腎組織Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原mRNA的表達增加［9］。降解Ⅲ型膠原的主要蛋白基質金屬蛋白酶的減少也是腎纖維化的一個重要原因［10］。已有研究證實血清P ⅢNP水平與Ⅲ型膠原纖維的合成總量成正比［11］。同時Ⅲ型膠原合成時PCⅢ也可經毛細血管進入血循環，因此血清PCⅢ、PⅢNP水平可以作為反映腎組織Ⅲ型膠原表達水平的間接指標。本研究輕、中、重度腎積水組患者血清PCⅢ及PⅢNP水平均明顯高于對照組，且隨積水程度加重血清PCⅢ、PⅢNP水平呈遞增趨勢;血清PCⅢ及PⅢNP水平與病變腎小管腎間質比率呈顯著正相關，說明檢測血清PCⅢ、PⅢNP水平可簡便、直觀的反映腎積水所致腎纖維化過程中病變腎小管腎間質的比率，間接反映腎間質纖維化程度。

腎臟纖維化過程中，產生基質的細胞活化是纖維化的關鍵。生理情況下，成纖維細胞產生適量的膠原基質充填腎單位、血管和腎被膜之間的空隙;而損傷及炎癥因素持續存在時，成纖維細胞會增殖并產生過量的細胞外基質(主要是Ⅲ型膠原)沉積于腎間質。成纖維細胞的增多主要有兩方面的原因:①腎纖維化早期，腎小球系膜細胞和纖維母細胞發生活化并向成纖維細胞轉變;②中晚期大量的腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化，主要轉化為成纖維細胞［12，13］。在腎纖維化模型中成纖維細胞可占到50%［14］，同時，當損傷因素持續存在時，各種細胞因子如表皮生長因子、轉化生長因子β作用于腎小管上皮細胞，使EMT現象更加明顯［14］。最終，成纖維細胞數量明顯增多并分泌大量的細胞外基質(主要是Ⅲ型膠原)沉積于腎間質，導致腎纖維化程度逐漸加重。本研究結果顯示，腎積水患者腎組織Ⅲ膠原的表達量與腎組織纖維化程度呈正相關。Ⅲ膠原主要分布在腎間質、腎小管基膜，說明腎積水腎間質纖維化，ECM過度沉積，Ⅲ型膠原是其中最重要的成分之一，主要分布在腎間質，腎小管基膜。同時也表明Ⅲ型膠原表達異常參與了腎積水所致腎組織纖維化的形成。Ⅲ型膠原合成增多、沉積以及降解的減少在腎積水導致腎纖維化過程中發揮著重要的作用。

綜上所述，尿路梗阻導致腎積水后，腎臟Ⅲ型膠原生成增加;隨著腎積水程度加重，Ⅲ型膠原增多越明顯;Ⅲ型膠原濃度改變與積水腎臟間質病變、腎纖維化密切相關，在排除腎外臟器纖維化的前提下，血清PCⅢ、PⅢNP水平在早期預測積水腎纖維化程度方面有一定價值。本研究的缺點是標本量較少，故本研究結果還需進一步研究證實。

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(收稿日期:2015-04-25)

文章編號:1002-266X(2015) 22-0090-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R692.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.037