HPLC技術分析測定黃曲霉毒素的研究進展

田瑞紅，孫健平

（天津桂發祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

HPLC技術分析測定黃曲霉毒素的研究進展

田瑞紅，孫健平*

（天津桂發祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

黃曲霉毒素是真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）產生的一類有毒的代謝產物，具有很強毒性，能強烈破壞人和動物的肝臟組織，嚴重時會導致肝癌甚至死亡。現已受到越來越多人群的關注。本文分別介紹柱前衍生化、柱后衍生化以及串聯質譜配合高效液相色譜技術分析食品里黃曲霉毒素的方法及研究進展。

黃曲霉毒素；高效液相色譜；食品

1 黃曲霉毒素（Aflatoxius，AFT）概述

黃曲霉毒素（Aflatoxius，AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類化學結構和理化性質相似次級代謝產物，目前已發現有20多種，已分離鑒定出結構的有B1、B2、M1等18種。AFT的基本結構為二呋喃環和香豆素，黃曲霉毒素的主要分子型式含B1，B2，G1，G2，M1，M2等。其中，B1則是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，其毒性和致癌性也最強。即含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。前者為基本毒性結構，后者與致癌有關。M1是黃曲霉毒素AFB1在體內經過羥化而衍生成的代謝產物，M1和M2則主要存在于牛奶中[1-3]。

1993年，黃曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物，是一種天然存在的、毒性極強的劇毒物質，并具有致突變、致畸形和致癌作用。黃曲霉毒素的危害主要是對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡[1-2，4-5]。

2 黃曲霉毒素的分離檢測方法

目前，檢測黃曲霉毒素的方法有很多。常用的主要有薄層層析法（TLC）、微柱篩選法、競爭性酶聯免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）以及新興起的電化學免疫傳感器法等。

TLC法雖然是經典方法，但其實驗過程耗時繁瑣且凈化效果不佳，易受雜質干擾，靈敏度、精密度和重現性不好，更適合于AFT的定性檢測。微柱篩選法僅適用于定性檢測，其重現性及靈敏度不佳。如若檢測多種AFT，需先將樣品分離再結合其他方法檢測。ELISA法靈敏高、特異性強、成本低、快捷，且熒光物質、色素、結構類似物對結果無干擾，適合于大批量樣品的檢測。但由于適用酶本身不穩定，在研制抗體時，交叉反應不僅要考慮其他真菌毒素及脂肪、蛋白、糖的干擾，還要考慮中藥中化學成分的干擾，因此會導致假陽性率高[6-7]。

HPLC技術可同時檢測多種類AFT，適于大批量樣品的分析。當前此法已普遍應用于食品、飼料及中草藥等黃曲霉毒素的分析檢測。隨著先進分析儀器設備的不斷推出涌現，精進后的HPLC法測定AFT，分析效果更佳[1，8]。

3 HPLC技術分析檢測黃曲霉毒素

梁雄宇等[9]將樣品均勻粉碎后，用丙酮提取花生中四種黃曲霉毒素后，經Bond Elut PH柱萃取凈化，再經更小粒徑的ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6mm×150mm，3.5μm）分離，以甲醇、乙腈和水混合為流動相，聯合紫外檢測器，以此方法很好地實現了對四種黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的分離。檢測限分別為：0.5、0.8、0.2、0.4μg/kg。對花生樣品加標回收，平均回收率在82%～96%。

然而，考慮到HPLC結合紫外檢測器（HPLC-UV）分析AFT可能存在的檢測靈敏度低，抗干擾能力差的不足，研究人員現在普遍使用HPLC-熒光檢測器法（HPLC-FLD）、HPLC與質譜聯用技術（LC-MS，LCMS/MS），將其應用到高通量復雜樣品中AFT的檢測，進而達到高精確度高靈敏度的的測定要求[10]。在樣品進入HPLC系統之前往往需要分析者對樣品進行前處理，即分離、純化過程。另外，在相同分析條件下，由于黃曲霉毒素分子熒光發射強度有所不同，熒光檢測器對每種黃曲霉毒素的檢測靈敏度不盡相同，即對結構中雙呋喃環上的具有飽和結構的B2和G2靈敏度高，而對黃曲霉毒素結構中雙呋喃環上具有不飽和雙鍵的B1和G1靈敏度較低，這樣一來通常還需對樣品進行柱前或柱后衍生化[11]。

3.1 柱前衍生HPLC法測定

王陽[12]、劉洋[13]、陳玉波等[14]將樣品經一定體積的乙腈溶液提取，所得提取液通過多功能固相萃取小柱或是自制凈化柱凈化、濃縮，再加入三氟乙酸（TFA）進行柱前衍生。隨后進HPLC體系檢測，C18色譜柱分離，配合熒光檢測器，外標法定量，樣品加標回收，回收率分別在80.4%～94.5%、85%～102%、78%～102%。該方法可同時檢測食品和飼料中多種黃曲霉毒素，線性范圍廣且效果良好。

另外，還可以在樣品中加入適量碘衍生劑，衍生后進行HPLC分析。程樹峰等[15]用甲醇-水（55∶45）提取后，對比了Si-Gel凈化柱、C18凈化柱、氯仿萃取3種純化方法的純化效果，分別就衍生劑的選擇、反應溫度、反應時間衍生試劑濃度進行討論，并確定出最佳的純化及衍生化條件。經此方法檢測4種黃曲霉毒素可在7min內完成，檢出限均在pg水平。花生和玉米重復性實驗（n=8）相對標準偏差（RSD）分別為4.2%～4.9%和3.2%～6.7%；樣品回收率分別為83.5%～ 97.3%和89.4%～97.6%。

3.2 柱后碘衍生及電化學衍生HPLC法測定

研究人員通常需要添加衍生化設備，采用一定濃度的碘溶液為衍生試劑對樣品進行衍生化處理，增強黃曲霉毒素的熒光強度，以更有效地完成測定。王樹茂[16]用84%乙腈水溶液提取樣品，通過Mycosep 226萃取柱凈化樣品，以Agilent Zorbax SB-C18為分離柱，乙腈/水為流動相，梯度洗脫，用熒光檢測器檢測。確定出最佳衍生條件，即0.1%碘溶液作衍生溶液，衍生液流速0.4mL/min；衍生溫度65℃，得到的結果線性關系良好，最低檢出濃度B1、G1為0.23μg/kg，B2、G2為0.10μg/kg，4種黃曲霉毒素的回收率在82%～100%之間，分析發現干（堅）果的品相與黃曲霉毒素污染程度正相關。

鄭榮[17]將樣品經70%甲醇提取、免疫親和柱凈化后，以甲醇—乙腈—水（27∶18∶55）為三元流動相，0.05%的碘溶液作衍生試劑，衍生反應溫度70℃，后用熒光檢測器測定，黃曲霉毒素G2、B2在15 pg～60 pg范圍內線性關系良好，黃曲霉毒素G1、B1在5 pg～200 pg范圍內線性關系良好，r＞0.999 9，回收率在60%～120%之間。

而在線電化學衍生（Kobra Cel1）是直接連在色譜柱和熒光檢測器之間，接通電源，利用電化學原理，以在線發生的溴為衍生劑，需要流動相中加入Br-，Br-在電流作用下被氧化成單質溴，后者與AFB1和AFG1反應，生成熒光強度更強的物質，此反應室溫下數秒內即可完成，解決了衍生物可能存在的穩定性問題，且不需要在流動相中加任何試劑，無需控制反應溫度、流速比例，省去了飽和碘溶液的制備過程[7，18]。

張鵬[18]用80%甲醇水溶液提取花生碎樣品，經免疫親和柱凈化，以三元流動相水-乙腈-甲醇（70∶15∶15）洗脫，在流動相中加入一定比例的KBr及濃硝酸供作衍生劑，以Kobra Cell裝置在線衍生，熒光檢測器檢測，13min內即可完成四種毒素的分離，檢出限均達到0.1μg/kg，5次平行測定花生樣品的RSD為9.2%～15%，加標樣0.5μg/kg～9.0μg/kg，回收率為74.8%～97.3%。

陳長法[19]優化了提取方式，選擇體積分數84%的乙腈水溶液，高速均質3min來提取花生碎樣品，采用多功能柱凈化結合柱后電化學衍生高效液相色譜熒光檢測花生中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，方法的檢出限為0.2μg/kg，檢測限為0.5μg/kg，相對標準偏差5.28%～9.56%，回收率85%～110%。

3.3 柱后光化學衍生HPLC法測定

吳燕[20]用乙腈-水（84∶16）溶液提取樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，經多功能柱凈化、高效液相色譜分離、光化學柱后衍生，熒光檢測器測定，AFB1、AFG1在0.10 ng/mL～10.0 ng/mL，AFB2、AFG2在0.03 ng/mL～3.0 ng/mL范圍內有良好的線性關系，其相關系數為0.999 5～0.999 8，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測限分別為0.50、0.15、0.50、0.15μg/kg，并選取空白大米和花生兩種樣品做回收測定，回收率為86.7%～97.2%，相對標準偏差（RSD）0.41%～2.40%。

目前，針對食品中黃曲霉毒素的檢測多采用免疫親和柱凈化—高效液相色譜—柱后光化學衍生—FLD測定的方法。

免疫學上，黃曲霉毒素這樣的小分子物質屬于半抗原，需要偶聯到大分子物質上制成人工抗原。將此人工抗原免疫動物后，即可得到高特異性、高效價的單克隆抗體。一定量的抗體固定在合適的載體蛋白上，即可得到相應的免疫親和柱[21]。樣品被免疫親和柱吸附后，再被極性有機溶劑洗脫。

楊美華等[22]首次通過免疫親和柱凈化—在線柱后光化學衍生-HPLC-FLD體系同時測定甘草中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2和赫曲霉毒素A（OTA）的含量。他們將樣品經甲醇—水（80∶20）超聲提取后在，在免疫親和柱上進行凈化富集，對比了甲醇-0.5%乙酸、乙腈-0.5%乙酸以及甲醇-乙腈-0.5%乙酸等梯度洗脫條件，最終選取甲醇-0.5%乙酸為流動相，在25min內可實現對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA的分離，檢測限分別為0.03、0.015、0.06、0.02、0.25μg/kg，平均樣品回收率為76%～103%，RSD低于13%。

光化學在線柱后衍生化裝置是將樣品通過紫外線照射，使流動相光解出有熒光特性的基團，與黃曲霉毒素B1、G1分子上的活性雙鍵進行羥基化反應，進而生成熒光特性更強、更穩定的物質，防止黃曲霉毒素B1、G1在水溶液中熒光淬滅[21，23]。衍生化裝置直接連在色譜柱和熒光檢測器之間，與其他需要加入額外的泵用衍生化試劑來提高熒光強度的的衍生體系相比，無腐蝕性，更穩定，反應快速穩定，操作簡便快捷，且靈敏度高，重現性好[11]。

3.4 HPLC-MS/MS法測定

目前檢測黃曲霉毒素的國標方法為免疫親和柱-液相色譜串聯質譜法。集高效分離和多組分定性、定量于一體的高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）技術在食品安全領域得到了廣泛應用，它將色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度這兩種優勢結合在一起，可以對多種化合物進行定性和定量分析。相比于HPLC法，該法無需進行柱前或柱后衍生處理，操作相對簡捷，該方法靈敏度更高，分析時間較短。

在液質聯用技術中，流動相的選擇要綜合考慮色譜系統分離效果以及分離各組分進入質譜后離子化的效率，以便獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，往往研究人員分別選用甲醇、乙腈與水混合做流動相作對比。更多的實驗表明，雖然乙腈在液相中的洗脫效果稍強于甲醇，但是用乙腈做流動相時的離子豐度明顯降低，說明乙腈的離子化效率低，所以通常采用甲醇作為流動相。為了促進樣品的離子化，可能會在流動相中分別加入一定濃度的甲酸、乙酸或是乙酸銨，大多結果表明加入甲酸時的離子豐度最強，且樣品各組分的分析時間也比較少，從而達到了快速檢測的目的[24-26]。

趙曉娟[27]把花生油樣品經甲醇-水、三氯甲烷依次提取，以C18柱分離，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液，進行梯度洗脫，采用電噴霧（ESI）正離子多反應監測（MRM）模式檢測。最終標準曲線在0.0μg/kg～20.0μg/kg進樣范圍內線性良好，并測定了4種黃曲霉毒素，其回收率在70.8%～108.0%（低加標水平）、82.4%～104.5%（中和高加標水平）之間，相對標準偏差在5.7%～9.7%之間。同時將此方法對市售19種不同品牌和批次的花生油中的黃曲霉毒素進行分析。

王巖松[28]把谷物樣品研磨成粉末，直接用體積分數10%的甲醇水溶液提取，經Oasis HLB固相萃取凈化，流動相選取乙腈-水（0.2%甲酸），進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描多反應監測（MRM）模式，外標法定量，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的定量下限分別為0.1、0.1、0.2、0.3、0.2ng/g，平均回收率在74.6%～89.6%之間，測試的精密度（RSD）在5.2%～11.3%之間。并用此法檢測了市購的10批陳年谷物和10批新谷物谷物樣品。

李培武[29]用液相色譜-電噴霧三重串聯四極桿質譜技術測定了玉米、大米、大豆等糧油固體樣品中黃曲霉毒素。利用超聲提取樣品，優化了超聲提取條件，選用體積分數80%甲醇-水（含40 g/LNaCl）為溶劑，溶液料液比為1∶3（g/mL），超聲溫度為50℃，超聲提取3min；后把提取的樣品經免疫親和特異性凈化，與液相色譜-電噴霧三重串聯四極桿質譜聯用，使用C18反相色譜柱，甲醇-10mmol/L乙酸銨水溶液作流動相，梯度洗脫，而采用黃曲霉毒素M1（AFM1）作為內標進行定量測定，測試結果得到AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的檢出限分別為0.002、0.004、0.004、0.012μg/kg，此方法的加標回收率為87%～111%，并測試了日內相對RSD和日間RSD，實驗結果表明該方法可有效地降低基質效應的影響。同時該課題組[30]采用同樣的前處理過程，免疫親和微柱凈化，液相色譜-串聯離子阱質譜法和高效液相色譜法同時測定花生、玉米和大米中的4類黃曲霉毒素并對這兩種方法進行了比較，更準確的反映出液相色譜-串聯質譜在實際應用中的優勢。

4 結語

黃曲霉毒素對糧食食品的污染非常廣泛，現如今，已經受到來自包括科學家們在內的各方面的特別關注。隨著先進儀器技術不斷發展，HPLC技術特異性強、靈敏度高、檢測限低、定量結果準確、自動化程度高的優勢愈發凸顯，而HPLC與各種先進分析手段、檢測設備的相互結合，已逐漸成為AFT檢測技術的發展趨勢。在未來，相信此項技術在食品等更多的領域黃曲霉毒素測定中發揮更大的作用。

[1]馬志科,昝林森.黃曲霉毒素危害、檢測方法及生物降解研究進展[J].動物醫學進展,2009,30(9)：91-94.

[2]韓珍,趙文紅,錢敏,等.黃曲霉毒素檢測方法研究進展[J].廣東農業科學,2011(13)：93-96.

[3]宋彬彬.黃曲霉毒素及其分析方法[J].飼料與添加劑,2011(7)：80

[4]勞文艷,林素珍.黃曲霉毒素對食品的污染及危害[J].北京聯合大學學報：自然科學版,2011,25(1)：64-69

[5]梁雄宇,黃義活,麥浪.小微粒色譜柱-高效液相色譜紫外檢測器法測定花生中黃曲霉毒素[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(3)：701-702

[6]李區.黃曲霉毒素分析方法進展[J].廣西水產科技,2005(3)：16-19

[7]謝廣有.黃曲霉毒素檢測方法進展[J].職業與健康,2011,27(6)：694-695

[8]羅超,李逢慧,程天印.黃曲霉毒素檢測方法研究概況[J].動物醫學進展,2008,29(增)：37-39

[9]梁雄宇,黃義活,麥浪.小微粒色譜柱-高效液相色譜紫外檢測器測定花生中黃曲霉毒素[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(3)：701-702

[10]馬志科,昝林森.黃曲霉毒素危害、檢測方法及生物降解研究進展[J].動物醫學進展,2009,30(9)：91-94

[11]劉堅,余敦年,熊寧,等.高效液相色譜法對稻谷及稻谷籽粒中黃曲霉毒素的測定研究[J].中國糧油學報,2011,26(4)：107-111

[12]王陽,曹忠波.柱前衍生高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(2)：344-345

[13]劉洋,陳枚.液相色譜法自制凈化柱測定飼料中5種黃曲霉毒素[J].糧食與飼料工業,2010(7)：60-61

[14]陳玉波,陳長毅.高效液相色譜法同時測定食品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2[J].食品科技,2009,34(9)：265-267

[15]程樹峰,唐芳,伍松陵.碘柱前衍生-高效液相色譜法快速測定糧食中黃曲霉毒素[J].糧食食品科技,2008,16(6)：40-42

[16]王樹茂.利用高效液相色譜檢測干 (堅)果中的黃曲霉毒素[J]. 2010,31(8)：112-115

[17]鄭榮,毛丹,王柯.柱后衍生-高效液相色譜法測定酸棗仁中黃曲霉毒素[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20(1)：36-37

[18]張鵬,張藝兵,趙衛東.免疫親和柱凈化、在線電化學衍生化高效液相色譜法檢測花生中的黃曲霉毒素[J].色譜,2000,18(1)：82-84

[19]陳長法,萬書波,鮑蕾,等,多功能柱凈化柱后電化學衍生法檢測花生中的黃曲霉毒素[J].天津農業科學,2010,16(6)：16-18

[20]吳燕,朱怡平,汪國權.多功能柱凈化－光化學柱后衍生高效液相色譜測定食品中黃曲霉毒素[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21 (8)：1865-1869

[21]劉麗娜,王瑩,金紅宇,等.HPLC法測定蟲草發酵粉中黃曲霉毒素殘留量[J].藥物分析雜志,2011,31(7)：1256-1259.

[22]胡一晨,萬麗,范成杰,等.免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學衍生化法檢測中藥及染菌中藥制劑中間體的黃曲霉毒素[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(10)：116-119

[23]楊小麗,韋日偉,申紅紅,等.免疫親和柱凈化光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法測定動物類藥材中黃曲霉毒素[J].中國藥業,2011,20(15)：4-5

[25]董彬,楊立新,李斌,等.多功能柱凈化液相色譜-質譜-質譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1[J].現代農藥,2011,10(4)：38-40

[26]朱聰英,應永飛,韋敏玨,等.液相色譜-串聯質譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究[J].質譜學報,2010,31(4)：242-246

[27]許勇,王少敏,毛丹,等.HPLC-MS/MS測定綠豆中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].齊魯藥事,2011,30(7)：380-382

[28]王少敏,許勇,毛丹,等.HPLC-MS/MS法測定中藥桃仁中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1[J].藥物分析雜志,2011,31(5)：907-911

[29]楊晶,欒國華,楊潤陸.液相色譜-串聯質譜法測定柏子仁中黃曲霉毒素殘留量[J].中國藥業,2011,20(14)：35-37

[30]許勇,王少敏,鄭榮,等.高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜分析法測定刀豆中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(1)：41-43

[24]馮偉科,羅佳玲,賴毅東.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定花生制品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].現代食品科技,2011, 27(8)：1040-1042

[25]鄭燕,王遠興,李瑾瑾.液相色譜串聯質譜法檢測食品中的黃曲霉毒素[J].食品科學,2010,31(24)：385-388

[26]楊靜,哈益明,王鋒.高效液相色譜-串聯質譜法檢測花生中的黃曲霉毒素B1[J].分析試驗室,2009,28(6)：35-38

[27]趙曉娟,冼燕萍,羅海英,等.液相色譜-串聯質譜法同時檢測花生油中4種黃曲霉毒素[J].食品科學,2011,32(14)：184-197

[28]王巖松,范世華,李華鋒,等.固相萃取-高效液相色譜/串聯質譜檢測谷物中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1[J].分析試驗室,2011, 30(10)：63-67

[29]王秀嬪,李培武,楊揚,等.液相色譜-三重串聯四極桿質譜測定糧油中的黃曲霉毒素[J].色譜,2011,29(6)：517-522

[30]范素芳,李培武,王秀嬪,等.高效液相色譜和高效液相色譜-離子阱質譜測定花生、玉米和大米中黃曲霉毒素方法比較[J].食品科學,2011,32(12)：254-258

Research Progress of Analysis and Determination of Aflatoxin by HPLC Technology

TIAN Rui-hong，SUN Jian-ping*
（Tianjin Guifaxiang 18th Street Muahua Food Co.，LTD.，Tianjin 300221，China）

Aflatoxin was a kind of toxic metabolite，which was produced by fungi（e.g.，aspergillus flavus and parasitic aspergillus）and had very strong toxicity.It could damage the liver tissue of humans and animals strongly，would lead to seriously liver cancer and even death.Attentions were paid by more and more people. Analysis methods and research progress of precolumn derivatization，post-column derivatization and tandem mass spectrometry cooperated with high performance liquid chromatography technology were introduced respectively in food.

aflatoxin；high performance liquid chromatography；food

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.041

2014-04-08

田瑞紅（1974—），女（漢），工程師，學士，研究方向：食品質量安全。

*通信作者