中藥復方對小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其抑制血管新生機制初步探討

王克強，陶 琳，王緒淮

(萊蕪市婦幼保健院，山東萊蕪 271199)

中藥復方對小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其抑制血管新生機制初步探討

王克強，陶 琳，王緒淮

(萊蕪市婦幼保健院，山東萊蕪 271199)

目的:觀察中藥復方肺金生方對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長和對新生血管的影響，初步闡明其可能的作用機制。方法:選取成功構建Lewis肺癌移植瘤模型C57BL/6小鼠48只，按隨機數字表法分為荷瘤對照組、順鉑組、肺金生方低劑量組、肺金生方高劑量組4組，每組12只，分別以相應藥物干預2周，取瘤塊稱重，計算腫瘤抑制率;采用SABC免疫組化法檢測Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的微血管密度(MVD);采用western blot法檢測Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的血管內皮生長因子(VEGF)蛋白和堿性纖維細胞生長因子(bFGF)的表達。結果:各組腫瘤質量中，順鉑組(1.65±0.15)g、肺金生方低劑量組(2.42±0.19)g、高劑量組(1.83± 0.16)g與荷瘤對照組(3.13±0.21)g比較差異有統計學意義;各組對Lewis肺癌小鼠腫瘤的抑瘤率分別為:荷瘤對照組0，順鉑組46.61%，肺金生方低劑量組27.32%，肺金生方高劑量組44.29%;各組MVD的值中，順鉑組(16.74±0.96)個，肺金生方低劑量組(19.31±0.85)個、肺金生方高劑量組(17.21±0.77)個與荷瘤對照組(29.98±1.06)個比較差異有統計學意義;Western blot結果顯示，各治療組的VEGF和bFGF蛋白表達均低于模型組，差異有統計學意義;肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達與順鉑組比較差異無統計學意義。結論:肺金生方可抑制血管新生對抗Lewis肺癌，其機制可能與抑制VEGF和bFGF相關。

中藥復方肺金生方;Lewis肺癌;血管內皮生長因子;堿性纖維細胞生長因子

肺癌尤其是原發性支氣管肺癌(Primary lung cancer)已經成為全球常見的惡性腫瘤之一。研究表明，我國肺癌的病死率在近30年內已經上升至46.5%，居于惡性腫瘤死亡原因的首位［1］。血管新生(angiogenesis)在機體的多種生理和病理過程中都起著至關重要的作用。肺癌作為常見的惡性腫瘤，血管新生同樣是該實體瘤增殖、侵襲和轉移的決定性因素，因此抗血管新生成是臨床上治療肺癌的一個關鍵靶點。肺金生方是由《金匱要略》經典方澤漆湯與現代藥理實驗結果相結合轉化而成的新方，其用于臨床治療肺癌療效相當顯著。盡管近年來對于肺金生方在臨床療效上的報道逐漸增多，但對其治療肺癌的作用機制研究極為少見。本研究采用C57BL/6小鼠構建Lewis肺癌移植瘤模型，觀察中藥復方肺金生方對其腫瘤生長和抑制率的影響，探究血管新生的相關指標微血管密度(MVD)、血管內皮生長因子(VEGF)蛋白和堿性纖維細胞生長因子(bFGF)的表達情況，以此探討肺金生方對肺癌治療的可能作用機制，以求為肺金生方的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

肺金生方由澤漆30 g、前胡10 g、人參、桂枝各9 g、紅豆杉枝8 g、蜂房15 g、石見穿30 g等組成，參照文獻［2］肺金生方低、高劑量分別相當于臨床成人用量的5、20倍，常規水煎濃縮成0.925、3.7 g/mL。滅菌后于4℃冰箱備用;順鉑20 mg/瓶，齊魯制藥廠(生產批號017023);達爾伯克氏培養基(DMEM):美國 Gibco BRL公司;胎牛血清(FBS):美國Hyclone公司;一抗:MVD、VEGF、bFGF和β-actin均購自美國 Santa cruz生物技術公司;電化學發光(ECL)試劑盒:上海碧云天生物技術公司;其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物與細胞

50只健康雄性C57BL/6小鼠，體質量(20±2) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司(許可證號SCKK(滬)2007-0005)。Lewis肺癌細胞株購自上海醫藥工程研究院。

1.3 主要實驗儀器

MCO-175型CO2培養箱:日本SANYO公司; SW-CJ-1F型潔凈工作臺:蘇凈集團安泰公司; Olympus CKX41型倒置顯微鏡:日本Olympus公司; Gel DOC XR凝膠成像分析系統:美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 Lewis肺癌細胞培養

將Lewis肺癌細胞株接種于培養瓶中，采用DMEM培養液(含10%FBS)置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，待細胞貼壁后取對數生長期的細胞消化傳代。

2.2 C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型建立及分組處理

取對數期Lewis肺癌細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度 1×107個/mL，于 20 min內每只C57BL/6小鼠右上肢腋窩皮下接種隔日觀察。接種5 d后待移植瘤長至直徑0.3～0.5 cm時，選取荷瘤成功的小鼠48只，按隨機數字表法分為荷瘤對照組、順鉑組，肺金生方低劑量組、肺金生方高劑量組每組各12只。接種5 d后晨起空腹給藥，荷瘤對照組給予0.9%氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;順鉑組于開始給藥的第1、3、5天尾靜脈給予順鉑注射液1 mL(含順鉑0.1 mg)，同時給予0.9 %氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;肺金生方低、高劑量組分別給予相應濃度的肺金生方0.4 mL灌胃，每日1次，共2周。

2.3 肺金生方的腫瘤抑制率計算

灌胃14 d后動物禁食不禁水12 h，脫頸處死后剝取瘤塊，完整剝取腋窩皮下腫瘤，去除血污脂肪等，電子天平稱取瘤質量。按照公式:抑瘤率=(1－用藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%，計算腫瘤抑制率。

2.4 C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤微血管密度(MVD)檢測

采用 SABC免疫組化方法，結果判定采用Weidner改進方法［3］。選擇最密集的5個微血管標記區，記錄5個視野內的微血管數 ，取其均數為MVD的值。

2.5 Western blot法檢測VEGF、dFGF蛋白表達情況

隨機取出凍存的腫瘤組織，于液氮中迅速研磨加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后，置4℃、12 000 g離心15 min取上清，BCA蛋白定量后，40 μg蛋白15%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE電泳、轉膜。5% 脫脂奶粉封閉4 h，一抗(VEGF、dFGF 1∶1 000)4℃過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1∶50 000)溫育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL試劑曝光，凝膠成像分析目標蛋白條帶灰度值并進行比較。

2.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況觀察

給藥2周后，各組C57BL/6小鼠均成活。荷瘤對照組小鼠活動明顯減少，對外界刺激反應不明顯，每日進食量減少，皮膚光澤不強。肺金生方低劑量組小鼠活動尚可，每日進食量尚可，皮膚光澤尚可。順鉑組和肺金生方高劑量組小鼠活動尚可，對外界刺激反應靈敏，每日進食量尚可，皮膚光澤度明顯優于其他組，提示肺金生方高劑量組小鼠與順鉑組小鼠生活質量優于其他組。

3.2 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠的腫瘤抑制率的影響

表1顯示，造模后各組均生成腫瘤，各組灌胃給藥14 d，脫頸處死后取瘤稱重結果，各組腫瘤質量為荷瘤對照組(3.13±0.21)g、順鉑組(1.65±0.15) g、肺金生方低劑量組(2.42±0.19)g、肺金生方高劑量組(1.83±0.16)g。順鉑組、肺金生方低、高劑量組與荷瘤對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，肺金生方高劑量組與順鉑組比較差異無統計學意義(P＞0.05);各組對Lewis肺癌小鼠腫瘤的抑瘤率分別為荷瘤對照組0，順鉑組46.61%，肺金生方低劑量組27.32%，肺金生方高劑量組44.29 %。

表1 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠腫瘤抑制率影響(±s)

表1 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠腫瘤抑制率影響(±s)

注:與荷瘤對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動物數量(只)瘤質量(g)抑瘤率(%) 44.29 12 3.13±0.21 0順 鉑 組 12 1.65±0.15＊＊ 46.61肺金生方低劑量組 12 2.42±0.19＊＊ 27.32肺金生方高劑量組 12 1.83±0.16＊＊荷 瘤 對 照 組

3.3 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的影響

表2顯示，采用 SABC免疫組化方法，各組MVD值分別為荷瘤對照組(29.98±1.06)個，順鉑組(16.74±0.96)個，肺金生方低劑量組(19.31± 0.85)個，肺金生方高劑量組(17.21±0.77)個;順鉑組、肺金生方低、高劑量組與荷瘤對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組與順鉑組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影響(±s)

表2 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影響(±s)

注:與荷瘤對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動物數量/只 平均MVD/個12 29.98±1.06順 鉑 組 12 16.74±0.96＊＊肺金生方低劑量組 12 19.31±0.85＊＊肺金生方高劑量組 12 17.21±0.77荷 瘤 對 照 組＊＊

3.4 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達的影響

表3圖1顯示，經Western blot法檢測后，順鉑和肺金生方低劑量、高劑量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表達;肺金生方低劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達量與荷瘤模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);順鉑組和肺金生方高劑量組的VEGF和bFGF蛋白表達量與荷瘤模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達與順鉑組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

4 討論

目前，肺癌已成為國內外最為常見的惡性腫瘤之一，而臨床上對于肺癌的治療除手術切除病灶以外，術后采用放化療是最為常見的輔助治療方法，但治療效果并不盡如人意［4］。肺癌尤其是原發性肺癌的發病率逐漸升高，因此在治療上迫切需要藥物的不斷更新和新藥的臨床應用。我國是中醫大國，從中醫角度分析，肺癌患者肺組織中積塊的產生是與正氣虧虛、邪毒入侵、氣機不利、氣血痰搏結有關［5］，因此降氣消痰為治療良方。肺金生方來源于《金匱要略》經典方澤漆湯，方中以澤漆為君，功專消痰行水，人參助澤漆逐水消痰、扶正固本;桂枝、前胡、生姜溫陽化飲、降氣消痰;人參、甘草健脾以扶正氣，佐黃芩以清泄水飲久留所化之郁熱，加用蜂房、紅豆杉散結消腫，共奏補肺散結、化氣消痰、止咳平喘之功［6］。該方已被用作肺虛痰阻型非小細胞肺癌的臨床治療方。龐德湘等［2］研究發現，該方可以抑制Lewis肺癌小鼠自發肺轉移，但對于肺癌發生發展的另一個重要因素血管新生的影響并沒有做深入探討，為此本研究從該靶點出發進行研究。

表3 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達的影響(±s)

表3 肺金生方對C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達的影響(±s)

注:與荷瘤對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動物數量/只 灰度值荷 瘤 對 照 組VEGF灰度值/ β-actin灰度值bFGF灰度值/ β-actin 12 0.889±0.021 1.013±0.062順 鉑 組 12 0.482±0.043＊＊0.591±0.037＊＊肺金生方低劑量組 12 0.729±0.045* 0.893±0.021*肺金生方高劑量組 12 0.513±0.017＊＊0.615±0.034＊＊

自1971年美國Folkman系統地提出了腫瘤血管生成的假說，認為實體瘤在2～3mm3時沒有新生的血管，若實體瘤繼續生長，就需要血管的保障來供應增殖所需的營養物質，因此抑制血管新生成為治療腫瘤的新靶點［7］。新生血管的生成是實體瘤細胞增殖的重要因素，研究發現腫瘤微血管密度( Microvascular density，MVD)增加后，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力會隨之提升，且腫瘤的惡性潛能也會隨之加大［8］。因此，MVD可以作為腫瘤細胞轉移、復發和預后的一個關鍵標志物，在腫瘤血管生成的評估中，可以衡量血管生成的活性，還可以檢測血管生成的強度，也可以作為一個穩定的評價指標來評估抗腫瘤血管生成藥物的治療效果。本研究結果顯示，肺金生方低劑量和高劑量均能降低C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的數量，與荷瘤對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

Folkman還指出，血管新生過程涉及到血管生成因子與血管生成抑制因子之間的平衡，一旦失衡將會嚴重影響血管的生成，這一過程還涉及到促血管生成因子的分泌以及內源性血管生成抑制因子產生的相應減少［7］。目前，已知血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是最重要的血管生長刺激因子［9-10］。VEGF作為促血管內皮增殖的細胞調控因子，通過與血管內皮細胞的特異性受體結合，促內皮增殖促血管生成，是目前所知作用最強的和特異性最高且與血小板衍生生長因子(PDGF)有1/5的同源性，幾乎在所有人體腫瘤和腫瘤細胞株中高表達［11］。bFGF可促進內皮中胚層或外胚層來源的細胞有絲分裂過程，是一種強有力的血管生成誘導因子。由于組織和細胞的差異，不同的bFGF亞型表現出不同的表達模式，在大部分非小細胞肺癌中均能檢測到bFGF的高表達，說明bFGF與腫瘤疾病的發展和預后密切相關［12］。另外，bFGF還與VEGF有協同作用，兩者與相應的特異性受體結合后，可通過一系列的信號傳導到通路促進新的血管生成［13］。

在本研究中我們發現，順鉑和肺金生方低劑量、高劑量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表達;肺金生方低劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達量與荷瘤模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);順鉑組和肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達量與荷瘤模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達與順鉑組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。因此我們認為，肺金生方可以通過抑制VEGF、bFGF等表達來實現抑制Lewis腫瘤血管生成的作用，進而達到抑制 Lewis肺癌的效用。但中藥的組成和合成是個復雜的多因素過程，其抗腫瘤細胞的作用機制也是多靶點、多通路的，因此我們需要進一步研究、確定肺金生方對腫瘤血管新生抑制作用的具體特異性有效靶點。

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Inhibitory Effect of Chinese Herbal Compound on Lewis Lung Cancer in Mice and Its Inhibition of Angiogenesis Mechanism

WANG Ke-qiang，TAO Lin，WANG Xu-huai
(Laiwu City，MCH，Shandong Laiwu 271199，China)

Objective:To observe the effects of traditional Chinese medicine compound lung Jinsheng prescription to the Lewis lung cancer tumor growth and angiogenesis in mice，preliminary to elucidate its possible mechanism.Methods: Lewis lung tumor was successfully constructed model C57BL/6 48 mice were randomly divided into 4 groups:control group，tumor-bearing，cisplatin group，lungs UBUKATA low dose group，high dose lung Jinsheng groups，each group had 12 mices.Respectively corresponding drug intervention two weeks，the tumor was weighed to calculate the tumor inhibition rate;western blot assay using mice with Lewis lung tumor tissue;using SABC immunohistochemical assay mice with Lewis lung tumor microvessel density(MVD)vascular endothelial growth factor(VEGF)and basic fibroblast protein growth factor(bFGF)expression.Results:The tumor mass in each group，cisplatin group(1.65±0.15 g)，lung Jinsheng low dosage(2.42±0.19 g)，high-dose group(1.83±0.16 g)and tumor-bearing control group(3.13±0.21 g)were statistically significant compared;inhibition rate of each group of mice with Lewis lung tumors were:tumor-bearing control group 0，cisplatin group 46.61%，lung Jinsheng low dosage group 27.32% ，44.29%of lung Jinsheng high dose group; MVD values in each group，cisplatin group(16.74±0.96 unit)，lung Jinsheng prescription low dose group(19.31± 0.85 unit)，lung Jinsheng high dose group(17.21±0.77 unit)and tumor-bearing control group(29.98±1.06 unit) were statistically significant compared with;Western blot showed that the expression of VEGF and bFGF treatment group were lower than the model group protein，the difference was statistically significant;lung Jinsheng high dose groups of VEGF and bFGF protein expression compared with cisplatin group，the difference was not statistically significant.Conclusion:Pulmonary Jinsheng only inhibit angiogenesis against Lewis lung carcinoma，which may be associated with inhibition of VEGF and bFGF.

Traditional Chinese medicine lung Jinsheng party;Lewis lung carcinoma;Vascular endothelial growth factor;Basic fibroblast growth factor

R285.5

B

1006-3250(2015)06-0671-04

2015-03-09

王克強，主管藥師，醫學本科，從事中醫藥的實驗與研究。