濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70的表達

龍劍文，皮先明，涂亞庭

(1.湖北中醫藥大學附屬醫院皮膚科，武漢 430061;2.華中科技大學協和醫院皮膚科，武漢 430000)

濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70的表達

龍劍文1，皮先明1，涂亞庭2

(1.湖北中醫藥大學附屬醫院皮膚科，武漢 430061;2.華中科技大學協和醫院皮膚科，武漢 430000)

目的:觀察濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70表達，探討其與濕疹不同證候發生的關系。方法:收集濕疹患者30例，包括風濕熱蘊證18例，血虛風燥證12例，另取健康人8名作為對照。熒光定量PCR檢測各組組織中NF-κB mRNA和HSP70 mRNA表達水平，Western blot法檢測皮損內核因子-κB、熱休克蛋白70蛋白表達。結果:HSP70 mRNA和蛋白表達，風濕熱蘊證組高于血虛風燥證組和健康對照組，差異有統計學意義;血虛風燥證組表達與健康對照組比較差異無統計學意義。NF-κB mRNA和蛋白表達，風濕熱蘊證組表達高于血虛風燥證組和健康對照組，差異有統計學意義;血虛風燥證組表達高于健康對照組，差異有統計學意義。結論:HSP70和NF-κB的表達程度可能體現了“濕瘡”病理過程中機體正邪力量，為揭示中醫濕瘡“證候”的本質提供了理論依據。

濕疹;證候;核因子-κB;熱休克蛋白70

濕疹是由多種內外因素引起的一種過敏性炎癥性皮膚病，臨床分為急性、亞急性、慢性濕疹。中醫學將其稱為濕瘡，外因風濕熱邪侵襲，內因脾失健運、濕熱內生，日久耗傷陰血，血虛風燥，肌膚失養?；罨腘F-κB可以通過調控炎癥因子的轉錄，引起炎癥反應。而熱休克蛋白70是在不良因素作用下所產生的一組具有高度保守性的應激蛋白，其表達可以通過增加血流量、促進細胞修復和增殖、抑制細胞凋亡、保護細胞免受氧自由基損傷等機制而達到促進炎癥消退、保護細胞的作用。因此，這兩者似乎在炎癥過程中扮演著邪氣正氣的角色［1］。本文通過觀察濕疹風濕熱蘊型、血虛風燥型患者皮損核因子-κB p65、熱休克蛋白70的表達，以期對濕疹不同證候的發生機制提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 病例選擇

濕疹診斷標準符合《臨床皮膚病學》［2］濕疹診斷標準，中醫證候分型符合《中醫外科學》［3］診斷標準。入組時至少2周內未局部使用糖皮質激素治療，1月內未系統使用糖皮質激素、免疫抑制劑及光療等，不伴其他基礎疾病及其他皮膚病。入組風濕熱蘊證18例，血虛風燥證12例，患者因診斷需要行組織病理學檢查，取材方法為環鉆取材或手術切除法，取材深度為真皮中下層，組織病理學符合濕疹診斷。8例正常皮膚組織來自外科門診正常包皮環切手術患者。

1.2 材料

分光光度儀為芬蘭雷勃公司產品(MultiskanMS，Labsystems Oy，Helsinki，Finland);細胞培養箱(美國熱電，3111型);全自動熒光定量PCR儀為Roche公司生產的lightcycler，Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen);QuantScript RT Kit(北京天根生化);SYBR green熒光實時定量PCR試劑盒(北京天根生化);兔抗人HSP70單克隆抗體、兔抗人NF-κB P65單克隆抗體(Santa cruz)。

1.3 方法

1.3.1 皮損標本 RNA提取、鑒定、逆轉錄及熒光定量PCR檢測。將皮損加Trizol后冷凍勻漿，置Eppendorf管15～30℃孵育5 min，加氯仿蓋緊蓋子用力搖動20 s，15～30℃孵育5 min，4℃12000 r/ min離心15 min，將上層水相轉入新的EP管中，加異丙醇孵育10 min。4℃12000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃7500 r/min離心5 min棄乙醇、干燥加焦碳酸二乙酯水溶解所得RNA，－80℃保存備用。每個樣品取5 ul RNA置l%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠液染色20 min，置紫外分光光度計測定波長260 nm吸光度值，測定RNA濃度。按反轉錄試劑盒說明書要求合成cDNA并檢索基因庫，應用Promo 5.0軟件設計上、下游引物。核因子-κB/P65mRNA上游引物:5-CGCAT CCAGACCAACAACA-3，下游引物:5-TGCCAGAG TTTCGGTTCAC-3，擴增片段長度217 bp。HSP70 mRNA上游引物:5-CACCACCTACTCCGACAACCA-3，下游引物:5-GCCCCTAATCTACCTCCTCAA-3。βactin上游引物:5-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3，下游引物:5-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3。取cDNA 1 μL，加2.5×RealMasterMix11.25 μL，上下游引物各1 μL，加無Rnase水至反應總體積25 μL; PCR反應條件:95℃變性2 min，PCR循環中95℃變性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸50 s，共40個循環。結果計算采用△Ct值法:△Ct=樣品的Ct均值－內參的Ct均值，-2△△Ct即某樣品初始cDNA的相對量。

1.3.2 Western-blot檢測皮損組織內HSP70、NF-κB蛋白表達 向－20℃保存的組織加入組織細胞蛋白提取液，用組織勻漿器冷凍勻漿。取出放入EP管中，4℃1200 r/min離心20 min，取上清液放入另一EP管中重懸于200 ul預冷的緩沖液中，冰浴10 min使細胞腫脹。加入 NP-40至終濃度為0.5%，振蕩10 s，4℃ 10000 g離心1min，小心吸取上清，此為胞質蛋白。沉淀物以預冷的緩沖液洗滌3次后，重懸于50 ul預冷的緩沖液中，冰浴30 min間斷振蕩，以抽提核蛋白;4℃12000 g離心20 min，小心吸取上清，內含核蛋白，測定蛋白濃度后，分裝凍存于－70℃備用。加樣、電泳、轉膜、封閉、洗膜后加入HSP70、NF-κB單克隆抗體(1∶400)，4℃過夜，再洗膜5 min 2次，換塑料袋，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，37℃搖床孵育1 h，洗膜5 min 2次。加入化學發光底物孵育，暗室感光、膠片感光，凝膠成像分析儀掃描、軟件分析圖像并讀取灰度值，以β-actin作為內參照。

1.3.3 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件進行統計分析，2組間均數比較用 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達的比較

表1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達比較(±s)

表1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達比較(±s)

注:與血虛風燥證組比較:◆P＜0.05;與健康對照組比較:▲P＜0.05;與血虛風燥證組比較:■P＜0.05

項目 例數 NF-κB mRNA HSP70 mRNA風 濕 熱 蘊 證 組 18 1.28±0.19◆ 1.34±0.21■8 1.00±0.02 1.00±0.01血 虛 風 燥 證 組 12 1.12±0.19▲ 1.06±0.18健康對照組

表1顯示，風濕熱蘊證組NF-κB mRNA表達高于血虛風燥證組，差異有統計學意義(P＜0.05);血虛風燥證組表達高于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。風濕熱蘊證組HSP70 mRNA表達高于血虛風燥證組，差異有統計學意義(P＜0.01);血虛風燥證組表達與健康對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組皮損NF-κB和HSP70蛋白表達比較

圖1、2顯示，風濕熱蘊證組核內NF-κB蛋白高于血虛風燥證組，差異有統計學意義(P＜0.01);血虛風燥證組表達高于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。風濕熱蘊證組HSP70蛋白高于血虛風燥證組，差異有統計學意義(P＜0.01);血虛風燥證組表達與健康對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 各組皮損NF-κB蛋白的表達

3 討論

濕疹是由多種內外因素引起的淺層真皮和表皮炎癥，屬于中醫學濕瘡范疇，中醫學認為濕瘡是由于稟賦不耐，風、濕、熱阻于肌膚所致。濕熱蘊久傷及陰血，血虛生風生燥，肌膚失養。

圖2 各組皮損HSP70蛋白的表達

HSP70是熱應激反應的重要標志物，可以被各種刺激誘導，對機體起內源性保護作用，其保護作用主要通過分子伴侶作用、抗炎、抗凋亡及抗氧化作用來實現［4-5］。研究表明，HSP的抗炎作用可能與其能穩定NF-κB/IκB復合體、阻止NF-KB的活化、從而減少炎性介質產生有關［6］。HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一類，類似中醫“正氣”的作用。NF-κB是一類能與多種基因啟動子特異性結合并促進轉錄的蛋白質總稱，幾乎存在于所有的細胞中，廣泛參與多種基因特別是免疫炎癥反應相關基因的表達調控，影響炎癥反應過程。NF-κB是P65/ P50組成的異源二聚體復合物，與抑制型IKB蛋白結合存在于細胞的胞漿中。在炎癥介質、應激反應等因素刺激下，IKB發生磷酸化并降解，NF-κB活性增加，P65和P50的mRNA轉錄增加，并發生核轉位與DNA上特定序列結合，其中P65含有轉錄活化區域，可促進多種炎癥相關基因的轉錄［7］，類似中醫“邪氣”的作用。高英等［8］研究表明，HSP60、NF-κB p65在中、重度特應性皮炎患者皮損角質形成細胞中均過度表達，與本文研究結果類似。崔娜娟等［9］研究表明，慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜核因子-κB mRNA、熱休克蛋白70 mRNA的表達均高于健康對照組，與本文濕疹風濕熱蘊證組結果類似，說明濕熱證患者局部損害可能存在核因子-κB/P65和HSP70的高表達。慢性胃炎脾氣虛證患者胃黏膜核因子-κB mRNA、熱休克蛋白70 mRNA的表達與健康對照組比較差異無統計學意義。而我們的研究表明，濕疹血虛風燥證患者皮損核因子-κB/P65 mRNA和蛋白的表達高于健康對照組，而熱休克蛋白70 mRNA和蛋白的表達與健康對照組比較差異無統計學意義。提示氣虛證和血虛證患者在局部細胞因子的表達上可能存在差異，尚需進一步研究。

本研究結果顯示，風濕熱蘊證組HSP70 mRNA及蛋白表達、NF-κB mRNA及蛋白表達均高于血虛風燥證組和健康對照組，反映出邪正相爭邪氣盛、正氣奮起抗邪的病理狀態。血虛風燥證組 NF-κB mRNA及蛋白表達高于健康對照組，HSP70 mRNA及蛋白表達低于風濕熱蘊證組，可能反映出邪盛正虛的病理狀態。綜上所述，HSP70、NF-κB的表達可能反映出中醫濕瘡正邪相爭的某些特點，為揭示中醫濕瘡“證候”的本質提供了理論依據。

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Expression of NF-κB and Heat Shock Protein 70 in skin lesion of patients with eczema in different syndromes

LONG Jian-wen1，PI Xian-ming1，TU Ya-ting2
(1.Department of dermatology，Affiliated hospital of Hubei university of Chinese medicine，Hubei Wuhan 430061，China;2.Department of dermatology，Union hospital of Huazhong University of Science and Technology Hubei Wuhan 430000，China)

Objective:To investigate the expression of Heat Shock Protein 70(HSP70)and NF-κB p65 in skin lesion of patients with eczema in different syndromes and the roles of them in eczema of different syndromes.Methods:30 cases of patients with eczema were collected，18 cases were wind-damp-heat syndrome，12 cases were blood deficiency and wind dryness syndrome，meanwhile，8 of healthy people were as control.The mRNA expression of NF-κB and HSP70 in tissues were determined quantitatively with FQ-PCR.The protein expression of NF-κB and HSP70 in tissues were determined quantitatively with western blot.Results:The mRNA and protein expression of HSP70 in the wind-damp-heat syndrome group was higher significantly than that in the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group.While there was no significantly different between the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group.The mRNA and protein expression of NF-κB p65 in the wind-damp-heat syndrome group was higher significantly than that in the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group;The mRNA and protein expression of NF-κB p65 in the blood deficiency and wind dryness syndrome group was higher significantly than that in and the control group.Conclusion:The expression level of NF-κB p65 and HSP70 may reflect the strengths of pathogens and vital Qi respectively.The result provided some clues to investigate the Chinese medicine“syndrome”nature of eczema.

Eczema;Syndrome;Heat Shock Protein 70;NF-κB

R752.1

B

1006-3250(2015)06-0694-03

2015-02-10