激光針灸對2型膠原蛋白誘導關節炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的影響機制

周 瑩，畢 群，劉 偉

(萊蕪市人民醫院，山東萊蕪 271199)

激光針灸對2型膠原蛋白誘導關節炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的影響機制

周 瑩，畢 群，劉 偉

(萊蕪市人民醫院，山東萊蕪 271199)

目的:探討激光針灸對2型膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的作用機制。方法:將40只大鼠進行編號分為空白對照組、模型組、藥物治療組和激光針灸治療組。激光治療組采用足三里和腎俞穴位進行針灸15次，觀察各組大鼠足腫脹程度并對各組大鼠的關節進行評分。提取大鼠的踝關節滑膜組織行HE染色，光鏡下觀察滑膜組織增生、炎性細胞浸潤、巨噬細胞增生及纖維組織增生的情況。結果:模型組的4種病理學組織評分和總評分均高于空白對照組和藥物、激光針灸治療組，差異有統計學意義;模型組足腫脹程度及關節評分高于空白對照組，差異有統計學意義。藥物治療組和激光治療組各指標之間比較差異無統計學意義。結論:激光針灸治療CIA大鼠能有效地抑制CIA大鼠踝關節滑膜組織的增生，其療效與藥物治療相當。

2型膠原蛋白誘導的關節炎;激光針灸;滑膜組織

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種系統性自身免疫性疾病，其特點是在多個關節滑膜出現慢性炎癥、軟骨破壞、骨侵蝕，出現關節腫脹、僵硬、畸形并伴有嚴重疼痛［1］。不受控制的RA可引起肺癌和心血管系統等多種組織的全身炎癥，導致并發癥和死亡率增加［2］。雖然RA的病因和發病機制還未完全理解，但促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高與疾病的進展和嚴重程度緊密聯系［3-4］。多項研究［5］顯示，激光針灸對RA的治療具有療效好、不良反應少等優點，但對其治療機制的研究仍然不甚明確。本研究報道了通過II型膠原誘導的關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討激光針灸對其保護作用，為臨床治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡健康SD雄性大鼠40只，清潔級，體質量(125±20)g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑與器材 連續半導體激光器(波長635 nm)由中國醫學科學院生物醫學工程研究所激光醫學實驗室研制。Ⅱ型膠原蛋白購自Chondrex公司，弗氏完全佐劑購自Sigma公司，扶他林購自北京諾華制藥有限公司，酶標儀購自MR公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組 將所有動物稱重后隨機編號為1-40號，1-10號為正常對照組，不做任何處理;將其余的90只大鼠采用II型膠原蛋白進行CIA造模。首先將用0.1M的冰醋酸溶解至濃度為2 g/L的溶液，于4℃過夜，加入等體積的弗氏完全佐劑，將兩者在冰浴中混勻乳化制成乳劑，且終濃度為1g/L。每只大鼠注射1ml該溶液，在背部皮下、尾根部和右后足跖部多點注射，1周后再次注射0.5ml加強免疫1次，建造II型膠原蛋白誘導的大鼠實驗性關節炎(CIA)模型［6］。模型建造后2周，將造模成功的大鼠按隨機數字表法分為為模型組(CIA模型組)、藥物治療對照組(即大鼠每天用0.8 mg/100 g劑量的扶他林乳液灌胃)、激光針灸治療組(即每只大鼠每天采用激光照射針灸治療)3組。模型組、正常對照組和針灸治療組每天注射生理鹽水。

1.2.2 取穴和針灸方法 ①取穴:參照“十一五”國家級規劃教材《實驗針灸學》的定位方法，取大鼠的足三里穴、腎俞穴［7］，腎俞穴在第2腰椎下兩旁、左右各1穴，足三里在膝關節后外側、腓骨小頭下0.5 cm處。在實驗過程中，采用交替治療單側穴位、左右交叉選取，即在第1天選擇治療左側足三里穴和腎俞穴，第2天則用右側足三里穴和腎俞穴，第3天再用左側進行交替治療。各組在激光針灸治療前對穴位區局部皮膚均進行剃毛、清潔處理。②激光針灸:在建造CIA模型致炎后第3周，將針灸治療組實驗動物以同樣固定架固定，對足三里穴、腎俞穴進行激光照射。激光輸出功率100 mW，功率密度1.42 W/cm2，光斑直徑均為0.3 cm，照射時間10 min，每日1次，共治療15次。

1.2.3 采集標本和指標檢測 1)大鼠關節評分和足腫脹觀察:在造模及藥物或針灸治療前后仔細觀察大鼠神志活動及體毛色澤的改變，在給藥或激光針灸前1 d，給藥后或激光針灸后的7 d、14 d，用足趾容積測量儀測量足趾的體積，測量3次取平均值，根據四肢的病變程度進行累計積分。2)采用關節炎指數(Arthritis Index，AI)對關節紅腫程度進行評定:關節無紅腫的為0分;個別足趾紅腫發脹為1分;大部分足趾及足底紅腫發脹為2分;踝關節以下全部腫脹為3分;累計踝關節以上腫脹及不能負重為4分。AI為四肢關節評分之和。3)提取滑膜組織與評分:實驗結束后處死所有實驗動物，將大鼠浸泡在100 g/L的強力消毒水中泡10 min，在超凈工作臺上固定后剪取左踝關節，切開皮膚后剝離滑膜組織，并用刀片完整切下。用甲醛溶液固定后石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色液(HE)染色后在顯微鏡下觀察滑膜組織的病理學改變。參照文獻，根據以下標準對滑膜組織病理變化進行評分。①滑膜細胞增生:無明顯(0)為0分;單層密集、腫脹(+)為1分;增生成2層(++)為2分;增生成3層及以上(+++)為3分;②炎性細胞浸潤:未見或偶見(0)為0分;稀疏散在少量(+)為1分，較密集中等量(++)為2分，密集大量(+++)為3分;③纖維組織增生:無增生(0)為0分，少量增生(+)為1分，中等量增生(++)為2分，大量增生(+++)為3分;④巨噬細胞增生:未見(0)為0分，稀疏散在少量(+)為1分，中等量(++)為2分，大量(+++)為3分。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，2組樣本間均數比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 激光針灸對大鼠身體及關節腫脹的作用

模型組與空白對照組比較，大鼠的活動有所減少，精神狀況萎靡，后肢關節部位在造模后第8天時出現紅腫且日益加重。采用藥物治療和針灸治療后，大鼠后肢的腫脹程度減輕，精神狀態良好，飲食正常。表1顯示，與模型組比較，給藥或激光針灸后14 d，左后肢的足容積明顯減小，差異有統計學意義，但均大于空白對照組和給藥前的足容積。表2顯示，經過藥物和激光針灸后，與模型組比較，關節炎指數AI明顯降低，且隨著治療時間的延長，腫脹程度逐漸減輕。

表1 激光針灸對CIA大鼠左后肢足容積的影響(±s，mL)

表1 激光針灸對CIA大鼠左后肢足容積的影響(±s，mL)

與空白對照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01;與給藥前比較:△P＜0.05

組給藥后7 d 14 d空白對照組別例數 給藥前1 d 10 0.511±0.189 0.532±0.078 0.575±0.113模 型 組 10 0.732±0.218## 0.913±0.218## 1.123±0.345##藥 物 治 療 組 10 0.744±0.111## 0.879±0.098##△ 0.846±0.077##＊＊△激光針灸治療組 10 0.779±0.056## 0.887±0.075##△ 0.814±0.145##＊＊△

表2 激光針灸對CIA大鼠四肢AI比較(±s，分)

表2 激光針灸對CIA大鼠四肢AI比較(±s，分)

注:與空白對照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與給藥前比較:△P＜0.05

組別鼠數 給藥前1 d 給藥后7 d 14 d空 白 對 照 組10 0 0 0模 型 組 10 6.9±5.2## 11.7±2.7## 14.3±4.2##藥 物 治 療 組 10 7.1±4.9## 9.2±3.1##＊△ 10.1±3.8##＊＊△激光針灸治療組 10 7.5±5.8## 8.9±5.3##＊△ 11.3±6.1##＊＊△

2.2 激光針灸對滑膜組織的影響

組織學檢查結果顯示，與正常組大鼠比較，CIA大鼠的滑膜關節中出現大量細胞浸潤、滑膜增生、關節狹窄(圖1B)，形成嚴重的血管。但在藥物治療組和激光針灸組，這些病理變化明顯減少(圖1C和1D)。表3顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠的滑膜增生、炎性細胞浸潤、巨噬細胞增生及纖維組織增生評分和總評分均有統計學意義，顯示造模成功，模型組大鼠的踝關節滑膜組織的病理學改變明顯。藥物治療和激光針灸組與模型組比較，滑膜增生、炎性細胞浸潤、巨噬細胞增生及纖維組織增生評分與總評分出現不同程度的下降，差異有統計學意義。

表3 激光針灸對CIA大鼠關節組織病理學評分影響(±s，分)

表3 激光針灸對CIA大鼠關節組織病理學評分影響(±s，分)

注:與空白對照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數 滑膜細胞增生 炎性細胞浸潤 巨噬細胞增生 纖維組織增生 總積分空 白 對 照 組10 0.22±0.13 0 0 0 0.22±0.13模 型 組 10 1.99±0.52## 1.97±0.28## 1.43±0.42## 2.61±0.43## 8.00±1.65##藥 物 治 療 組 10 1.67±0.49##* 1.29±0.31##＊＊ 1.01±0.38##＊＊ 1.45±0.22＊＊ 5.42±1.40＊＊激 光 針 灸 治 療 組 10 1.45±0.85##＊＊ 1.09±0.53##＊＊ 0.98±0.31##＊＊ 1.15±0.34＊＊ 4.68±2.03＊＊

圖1 激光針灸對CIA大鼠關節組織病理學影響空白對照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.激光針灸治療組

3 討論

風濕關節炎是一種復雜的難治性自身免疫性疾病，特點是關節疼痛、多發性關節炎、關節破壞，它是由不同致病因素造成的，包括全身和局部炎癥、細胞和體液免疫反應、廣泛的血管生成、基質金屬蛋白酶和破骨細胞破壞骨骼和軟骨［8-10］，但其具體的發病機制尚不明確。表4顯示，激光針灸可以抑制滑膜細胞和纖維組織增生，減少炎性細胞浸潤，與對照藥物扶他林比較，療效相當，差異無統計學意義。且激光治療可以緩解足腫脹，降低大鼠四肢的AI值，但激光針灸治療的作用機制尚待進一步研究，可能是與加快血液循環有關。

對該病機制的研究，模型的選擇是至關重要的。與經典的佐劑誘導關節炎 (agjuvant-induced arthritis，AIA)比較，CIA模型的臨床表現、發病機制和病例特點以及免疫學指標與人的RA比較，具有更多的相似性和可比性，是目前國內比較認可的用于研究RA的動物實驗模型［11-12］。在本研究中，采用CIA造模2周后，大鼠的踝關節出現滑膜增生、纖維組織和巨噬細胞增生、炎性細胞浸潤，與正常組大鼠比較差異有統計學意義。這些病理學表現表明，模型組的病理學改變與人的RA接近，說明該模型對于后續的激光針灸治療結果具有更好的可靠性。

在該病的發病過程中，4種病理學改變反映了RA的發病程度，滑膜細胞增生是RA發病的早期反應，隨著病程的延長，會出現滑膜組織增厚、關節黏連等病理學改變，該反應是該病發病過程中的最直接反應［13-14］。炎性細胞的浸潤反映了免疫反應的激烈程度。該研究結果顯示，藥物組和激光針灸組均有一定程度的炎性細胞浸潤，但與模型組比較有所下降，差異有統計學意義，說明藥物或者激光治療具有一定程度減輕炎性反應的作用。巨噬細胞分為A型和B型，是滑膜襯里層的2種主要細胞，主要來源于血液中單核細胞的浸潤轉移［10］。纖維組織增生則反映了炎癥破壞后纖維組織轉移后的修復情況，纖維組織增生越嚴重，說明關節的軟骨破壞越大［15］。我們的研究結果顯示，藥物治療和激光治療均有一定程度抑制纖維組織增生的作用，且隨著治療時間的延長效果更明顯。

總之，激光針灸治療CIA大鼠，對大鼠踝關節的滑膜組織增生和纖維組織增生具有一定的抑制作用，其作用效果和藥物治療效果相當，但其治療作用機制還有待進一步的研究。該治療手段也許可以作為不愿服藥或者藥物治療效果差患者的主要或輔助治療手段。

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The Effects and Mechanisms of Laser Acupuncture and Moxibustion Treatment to in Synovial Tissue Pathological Changes Type II Collagen Induced Arthritis Model Rats

ZHOU Ying，BI Qun，LIU Wei
(Laiwu City People's Hospital，Shandong Laiwu 271199，China)

Objective To investigate the effects and the mechanism of laser acupuncture and moxibustion treatment to the in the type II collagen induced arthritis(CIA)model rats of synovial tissue pathological changes.Methods:40 rats were divided into control group，model group，treatment group and laser acupuncture and moxibustion treatment group.Laser treatment group with Zu Sanli and Sheshu point acupuncture for 15 times，observed each group rats foot swelling degree and rate of each group rats joints.Extracted rats joints and HE staining，ankle synovial tissue in rat were observed under light synovial tissue，inflammatory cell infiltration，macrophage proliferation and fibrous tissue hyperplasia.Results: Pathological tissues in the model group of 4 score and total score were higher than control group and laser acupuncture and moxibustion treatment group，the difference was statistically significant.In the Model group，the foot swelling degree and the joints of score higher than the blank control group，and the difference was statistically significant.Drug treatment group and laser therapy group have no statistical significance difference.Conclusion:Laser acupuncture and moxibustion treatment of CIA rats，can effectively inhibit the CIA rats ankle synovial tissue hyperplasia.

CIA;laser acupuncture and moxibustion;synovial tissue

R245.9+7

B

1006-3250(2015)06-0725-03

2015-04-17

周 瑩(1971-)，女，主治醫師，醫學本科，從事中醫針灸的臨床與研究。