一株拮抗菌C-5的分離及鑒定

韋 露 陳 償 龍云映 蔡奕明

(1.中國科學院 南海海洋研究所 廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 2.中國科學院大學 北京 100049; 3.暨南大學 生命科學技術學院, 廣東 廣州 510632)

海地瓜(Acaudina molpadioidea)是屬于海參綱(Holothuriodea), 芋參目(Molpadida), 尻參科(Caudinidae), 海地瓜屬(Acaudina)[1]。其資源豐富, 廣泛分布于中國沿海海域。海參養殖產業是沿海漁民增收致富和捕撈漁民轉產轉業的新途徑, 受市場需求和利潤的驅使, 養殖速度不斷加快, 規模不斷壯大, 密度過高,容易造成病害暴發。弧菌(Vibrio)是危害水產養殖動物的主要病原菌[2], 目前, 生產中防治細菌性疾病常用的方法是使用抗生素, 而大量抗生素的施用會導致藥物殘留和耐藥菌株的出現, 人們食用含抗生素殘留的海鮮產品, 也會威脅健康, 這些負面效應日益引起人們的關注, 因此, 積極尋找抗生素的替代品顯得尤為重要[3]。其中, 開發綠色環保的益生菌已成為國際上研究的熱點[4-5]。

益生菌是一種活的微生物, 能夠維持宿主腸道平衡、增強新陳代謝、促進生長發育、改善微生物生態調控, 從而提高宿主動物的健康水平、增強機體免疫力, 也被稱為微生態調節劑[6]。Kozasa[7]首次將微生態制劑應用于水產上, 用從土壤中分離的芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺(Anguilla japonica),降低了愛德華氏菌引起的死亡, 從此益生菌的研究迅猛發展。目前, 潘雷等[8]已經報道, 餌料中添加益生菌可以改善大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚的腸道菌群以及顯著提高了部分免疫指標; 張漢華等[9]研究指出, 益生菌可以對對蝦養殖系統起到生態調控的效果; 鄒文政等[10]發現, 從養殖水體中可以篩選出對大黃魚(Pseudosciaena crocea)病原弧菌有明顯拮抗作用的海洋細菌。

微生態制劑因其無毒、無殘留、抗藥性小、生態健康等特點成為近年來海水養殖的改良劑[11]。雖然市場上已有多種有益菌產品, 但是多數是國外進口或者陸源性菌株, 目前, 尚未有報道來源于地瓜參腸道的益生菌株生產微生態制劑。本研究目的是從健康的野生地瓜參腸道內分離篩選對病原弧菌具有拮抗作用的益生菌, 進一步在養殖生產中應用微生態制劑、控制疾病、改良水質、提高養殖動物存活率和免疫力等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 實驗菌株

從地瓜參腸道共分離到81株細菌作為體外拮抗供試菌株。

1.1.2 病原性指示弧菌

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)13150 (Vp13150)購自廣東省疾病預防與控制中心(CDC), 為魚類致病菌。

1.1.3 其他指示菌

枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、紫色桿菌(Chromobacterium.Violaceum) CV026、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)(E167)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)199(A.saL)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae) 006, 解淀粉芽孢桿菌(L1) (Bacillus amyloliquefaciens)L1(解淀粉芽孢桿菌L1為事先經過拮抗實驗沒有拮抗性的細菌),均由本實驗室保藏。上述所有菌株均用普通LB培養基, 30 ℃恒溫培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌的篩選與抗菌譜測定

從地瓜參腸道分離到81株待測菌株, 參照文獻[12]的瓊脂擴散法進行測定, 以抑菌圈大小初步判定抑菌活性, 并將初篩得到的拮抗菌測定其對 7株病原指示菌的抑菌譜。

1.2.2 拮抗菌的鑒定

采用Biolog細菌鑒定系統, 進行菌株95種碳源利用的理化分析。以C-5總DNA為模板, 以通用引物(27F和1492R)對其16S rDNA進行PCR擴增[13],經測序后所得序列提交至NCBI進行Blast同源性比對, 確定其在系統進化中的位置, 進行分子鑒定。

1.2.3 拮抗菌C-5胞外產物對病原菌的抑菌作用

參照Sugita[14]的方法, 制備拮抗菌的胞外產物。以副溶血弧菌 Vp13150為病原指示菌, 以無拮抗性菌株 L1胞外產物作對照組, 加入等量 C-5無菌上清,同時做3個平行, 每隔2 h取樣測定OD600, 繪制曲線。

1.2.4 鹵蟲安全性實驗

根據 Goulden[15]的方法, 將過夜孵化 30只鹵蟲放入無菌海水, 運用12孔板, 加入 5個濃度梯度的細菌(C-5 和 Vp13150)至終濃度為 104、105、106、107、108cfu/mL, 不加細菌孔為對照組。所有處理需做 3個平行, 連續觀察 3 d, 計算鹵蟲死亡率, 并采用寇氏法計算半致死濃度。

采用寇氏法(Karber氏法), lg LC50=XK-C∑[Pi+P(i+1)] , 式中:XK為最大劑量的對數;C為相鄰劑量比值的對數;Pi、P(i+1)為各劑量組的死亡率。此時試驗組對應的濃度LC50, 即為半致死劑量濃度。

1.2.5 藥敏實驗

采用常規的瓊脂擴散(K-B)法, 對篩選得到的拮抗菌 C-5菌株進行 20種常用抗生素的敏感性測定,以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標[16]。

1.2.6 優化拮抗菌的生長條件

研究3個培養條件(pH、溫度、NaCl質量分數)對拮抗菌C-5生長的影響。

溫度: 10、20、25、30、37、45 ℃

pH值: 4.0、5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0

NaCl質量分數: 0%、1%、2%、3%、4%、5%

以上實驗除了考察因素外, 發酵條件都是在接種量1%、30 ℃、200 r/min下培養24 h后, 取樣測定各條件的OD600值, 以不接菌的LB培養基作空白對照。以培養溫度、初始pH、NaCl質量分數為橫坐標, OD600值為縱坐標繪制各自曲線[17]。

1.3 數據統計

實驗數據采用Origin 8.1, SPSS17.0中的單因素方差分析(ONE-WAY ANVOA)進行統計分析, 均值采用Duncan法進行多重比較, 數據以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 拮抗菌的篩選與抗菌譜

先分離得到的 81株細菌, 再用打孔法篩選到 1株抑菌譜較廣且對副溶血弧菌具有較強抑制作用的拮抗菌 C-5, 其抗菌譜結果見表1。結果顯示, 除副溶血弧菌外, C-5對其余溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌等病原菌有拮抗作用, 此外還能有效抑制臨床的霍亂弧菌和紫色桿菌。從余下拮抗性較弱的80株中, 挑出一株L1作為后續試驗的陰性對照菌。

表1 C-5和L1對7種指示菌的抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activities of the bacterium C-5 and L1 towards 7 indicator bacteriums

2.2 拮抗菌C-5的鑒定

拮抗菌C-5的生理生化檢測結果見表2, 菌株C-5菌落形態呈灰白色, 革蘭氏陰性, 發酵葡萄糖、果糖、麥芽糖等多種糖類, 可利用檸檬酸鹽, 不液化明膠等。

表2 C-5菌株的生化特征Tab.2 Biochemical analysis of isolated C-5

16S rDNA測序結果比對可知(圖1), 其與霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)TMPSB-T10 (EU 047556.1)同源性99%。屬于霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)中的成員, 此菌株在 NCBI上的登錄號為 KJ660958, 依據鑒定結果并結合菌株號, 最后鑒定該拮抗菌C-5為腸桿菌屬Enterobactersp.

圖1 基于16S rDNA構建C-5的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of C-5 base on 16S rDNA

2.3 拮抗菌 C-5的胞外產物對副溶血弧菌的抑菌作用

從圖2可知, 實驗組副溶血弧菌的生物量從0～4 h為遲緩期, 細菌幾乎沒有生長; 5～12 h為對數期, 細菌量急劇增長; 12～14 h為穩定期, 維持在一定水平; 16 h后為衰退期, 生物量逐漸下降; 對照組0～10 h一直穩定在較低水平, 至12 h后開始緩慢上升。

圖2 拮抗菌C-5胞外產物對副溶血弧菌Vp13150的抑菌作用曲線Fig.2 Inhibitory curve of extracellular products of antagonistic bacterium C-5 against V. parahaemolyticus13150

2.4 鹵蟲毒性實驗

半致死濃度(LC50)測定實驗表明鹵蟲感染副溶血弧菌72 h后的LC50為105cfu/mL, 感染拮抗菌C-5的LC50為108cfu/mL。具體結果見表3。

表3 不同濃度C-5和Vp13150條件下鹵蟲的死亡率Tab.3 Mortalities of Artemia nauplii with different doses of C-5 and Vp13150

2.5 藥敏實驗

供試的一株潛在益生菌C-5對20種抗生素類藥物的敏感性實驗結果見表4, 可見菌株C-5對15種抗生素均敏感, 僅對四環素、復方新諾明、諾氟沙星、頭孢哌酮、氨芐西林5種抗生素產生耐藥。

表4 菌株C-5藥敏實驗結果Tab.4 Results of antibiotic sensitive test of strain C-5

2.6 初步優化拮抗菌C-5的發酵條件

pH對拮抗菌 C-5生長的影響實驗結果表明(圖3), 菌株C-5的最適生長初始pH為7。初始pH范圍為4～11時, C-5的OD600值隨著pH的升高而增加, 當pH為7時, C-5的OD600值達到最大值1.503; pH大于7時, OD600值逐漸降低; 當pH過酸(pH=4、5)或者過堿(pH=10、11), 菌株C-5幾乎不能生長。

圖3 pH對菌株C-5生長的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of strain C-5

溫度對拮抗菌C-5生長的影響實驗結果表明(圖4),菌株C-5在20～40 ℃溫度范圍內均能生長, 其中C-5的最適生長溫度為30 ℃。在20～30 ℃范圍內, 隨著培養溫度的升高, C-5的OD600值逐漸增大, 在30 ℃時達到最大值 1.579; 當溫度大于 30 ℃時, C-5的OD600值逐漸降低。當培養溫度過低(10 ℃)或過高(45 ℃)時, C-5的OD600值最低, 幾乎不生長。

圖4 溫度對菌株C-5生長的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of strain C-5

鹽度對拮抗菌C-5生長的影響實驗結果表明(圖5),菌株C-5在0～5%鹽度范圍內均能生長, 其中C-5的最適生長鹽度為2% NaCl。在0～5%范圍內, 隨著鹽度的升高, C-5的OD600值逐漸增大, 在2%時達到最大值1.462; 當大于2%時, C-5的OD600值逐漸降低。

圖5 鹽度對菌株C-5生長的影響Fig.5 Effect of NaCl on the growth of strain C-5

3 討論

海參腸道菌群是一個復雜的微生物群落, 其構成不但與海參種類和大小有關, 還受到外界環境因素, 如水體、飼料中微生物等的影響。一般認為, 海參腸道的優勢菌群為革蘭氏陰性菌, 如弧菌、假單胞菌屬等[18]。腸道細菌在長期的進化過程中, 逐漸定植并繁殖, 形成固有菌群, 通過分泌抗菌物質抑制其他細菌的繁殖和生長[19]。作者從地瓜參腸道內分離弧菌拮抗菌, 擴大細菌的來源, 其作為土著微生物對于定植和繁殖并有效抑制病原菌有極大的優勢。

目前, 微生態制劑的市場需求非常大, 可是其種類和功能卻參差不齊, 在一定程度上影響了其市場前景。以海水養殖動物腸道和養殖環境作為來源的土著微生態制劑的開發和應用發展較為緩慢, 因此, 分離培養并研制土著微生物益生菌制劑意義重大[20]。近年來, 許多研究工作者都把重心放在分離乳酸菌上[21], 而本實驗首次從地瓜參腸道分離出一株益生腸桿菌, 并從生理生化、分子生物學方面進行了鑒定, 確定為霍氏腸桿菌, 編號為 C-5, 為今后地瓜參池塘養殖微生態環境調控, 控制病害頻發, 提供了優良的土著菌株, 具有廣闊的開發應用潛力。

本實驗對篩選到的益生菌 C-5做了基礎的相關研究, 發現其抑菌譜廣, 對副溶血弧菌、溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌等有很強的拮抗作用, 表明其體外抑菌效果明顯。拮抗菌 C-5發揮抑菌作用主要是其產生的胞外產物, 本實驗表明, 在最初的 10 h能抑制部分病原副溶血弧菌, 10 h后病原菌的數量才開始上升, 這種現象可能是由于抑菌物質的活力隨著時間和環境的改變而下降, 最終使得病原菌重新繁殖[22]。一般認為, 確保益生菌的安全性是其應用于水產養殖的前提, 而評價安全性一個最直接的方法是確定半致死濃度(LC50)[23]。本研究采用鹵蟲(Artemia)體外浸浴方法, 證實拮抗菌 C-5對養殖動物的活餌料鹵蟲是無毒的, 菌株 C-5對鹵蟲的 72 h LC50為 108cfu/mL。細菌的LC50≤103cfu/mL被認為是高致病性,而 LC50≥107cfu/mL被認為是無致病性的[24]。一般來說, 細菌產生抗菌物質的濃度與其生長條件密切相關, 如pH值、培養溫度等[25]。本實驗優化了C-5的生長條件, 其最適溫度為30℃, 最適初始pH為7,最適生長鹽度為 2%NaCl, 說明其發酵條件溫和, 適合擴大培養。另外, 其抑菌成分主要分泌到胞外, 分離簡單, 這些也為發酵工程奠定基礎。

近年來, 養殖業病害頻發, 如何更加有效地利用拮抗菌的抗菌作用來抑制病原菌、減少化學藥物(抗生素類)的使用、降低水產品體內藥物殘留、保護生態環境、發展綠色經濟產業、形成一個健康穩定的良性循環, 這是生物防治技術未來的發展方向。本實驗針對地瓜參病原菌的拮抗微生物進行了較為基礎的研究, 如何將篩選到的益生菌 C-5真正應用于水產養殖, 其定植模式、生長動力學、抑菌機理等還有待進一步研究。

[1] 廖玉麟.中國動物志: 棘皮動物門、海參綱[M].北京:科學出版社, 1997: 1-336.

[2] Gatesoupe F.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture, 1999, 180(1-2): 147-165.

[3] Balczar J L, Blas I D, Ruiz-Zarzuela I, et al.The role of probiotics in aquaculture[J].Veterinary Microbiology,2006, 114(2): 173-186.

[4] Cai Y, Benno Y, Nakase T, et al.Specific probiotic characterization ofWeissella hellenicaDS-12 isolated fromflounderintestine[J].Journal of General and Applied Microbiology, 1998, 44(5): 311-316.

[5] 劉文斌, 尹君, 方星星, 等.3種益生素配伍對異育銀鯽生長、消化及腸道菌群組成的影響[J].海洋與湖沼,2007, 38(1): 29-35.

[6] 沈德中.污染環境的生物修復[M].北京: 化學工業出版社, 2002: 1-356.

[7] Kozasa M.Toyocerin (Bacillus toyoi) as growth promotor for animal feeding[J].Microbiologie Aliments Nutrition, 1986, 4: 121-135.

[8] 潘雷, 郭文, 高鳳祥, 等.餌料中添加益生菌對大菱鲆幼魚腸道菌群及部分免疫指標的影響[J].海洋科學, 2012, 36(2): 34-39.

[9] 張漢華, 李卓佳, 郭志勛, 等.益生菌對海水蝦池浮游生物的生態調控效果研究[J].海洋科學, 2009,33(1): 12-20.

[10] 鄒文政, 鄢慶枇, 林文雄, 等.大黃魚病原弧菌拮抗菌篩選[J].海洋科學, 2004, 28(3): 5-9.

[11] 王亞敏, 王印庚.微生態制劑在水產養殖中的作用機理及應用研究進展[J].動物醫學進展, 2008, 29(6):72-75.

[12] 馬桂珍, 付泓潤, 王淑芳, 等.海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株生產抑菌物質發酵條件及其抑菌譜的研究[J].食品科學, 2012, 33(19): 231-235.

[13] Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A, et al.16s Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697-703.

[14] Sugita H, Hirose Y, Matsue N, et al.Production of antibacterial substance byBacillusspp.Strain NM12,an intestinal bacterium of Japanese coastal fish[J].Aquaculture, 1998, 165(3-4): 269-280.

[15] Goulden E F, Hall M R, Bourne D G, et al.Pathogenicity and infection cycle ofVibrio owensiiin larviculture of the ornate spiny lobster (Panulirus ornatus)[J].Applied and Environmental Microbiology,2012, 78(8): 2841-2849.

[16] 劉春, 李凱彬, 王慶, 等.雜交鱧(斑鱧♀×烏鱧♂)內臟類結節病病原菌的分離、鑒定與特性分析[J].水產學報, 2012, 36(7): 1119-1125.

[17] 曹海鵬, 楊先樂, 王玉潔, 等.鱘源致病性豚鼠氣單胞菌的分離及其生長特性[J].動物學雜志, 2007,42(6): 1-6.

[18] 王軼南, 朱世偉, 常亞青.刺參腸道及養殖池塘菌群組成的PCR-DGGE指紋圖譜分析[J], 漁業科學進展,2010, 31(3): 119-122.

[19] 陳營, 王福強, 王凡.牙鲆腸道內弧菌拮抗菌的分離與篩選[J].海洋科學, 2003, 27(3): 43-46.

[20] 佟偉, 張勁松, 孟凡義, 等.微生態制劑在池塘海參生態養殖中的應用[J].當代畜牧, 2014, 1(2): 88-90.

[21] Sugita H, Ohta K, Kuruma A, et al.An antibacterial effect ofLactococcus lactisisolated from the intestinal tract of the Amur catfish,Silurus asotusLinnaeus[J].Aquaculture Research, 2007, 38(9): 1002-1004.

[22] Ringo E, Gatesoupe F J.Lactic acid bacteria in fish: a review[J].Aquaculture, 1998, 160(3-4): 177-203.

[23] 曹海鵬, 何珊, 王會聰, 等.我國水產拮抗芽孢桿菌的研究進展[J].食品科學, 2012, 33(9): 314-318.

[24] Vinoj G, Vaseeharan B, DavidJayaseelan B, et al.Inhibitory effects ofBacillus licheniformis(DAB1) andPseudomonas aeruginosa(DAP1) againstVibrio parahaemolyticusisolated fromFenneropenaeus indicus[J].Aquaculture International, 2013, 21(5): 1121-1135.

[25] 莫照蘭, 俞勇, 李會榮, 等.弧菌拮抗菌的篩選[J].青島海洋大學學報, 2001, 31(2): 225-231.