新疆傳統干酪中1株產廣譜細菌素乳酸菌的篩選及其生物學特性

楊尚嬌，倪亞雯，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

細菌素是不同于抗生素的一種抑菌物質，其是一類在細菌代謝過程中通過核糖體合成機制產生的具有抑菌活性的蛋白質或多肽[1]。乳酸菌代謝產生的細菌素稱為乳酸菌素[2]。細菌素一般可以廣泛抑制革蘭氏陽性（G+）腐敗菌和致病菌，有些甚至可以抑制某些革蘭氏陰性菌（G-）、真菌和病毒的生長，同時，細菌素對產生菌自身有免疫性[3]。細菌素被稱為“生物食品保鮮劑”，其優勢在于無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留，能夠取代化學防腐劑和抗生素在食品生產過程中的使用，在食品保鮮領域具有巨大的開發應用價值[4]。如今，在食品工業中應用多種乳酸菌素抑制食物腐敗菌和病原微生物的生長。文獻報道的乳酸菌素主要是乳球菌屬的雙球菌素（Diplococcin）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、乳球菌素（Lactococcin）、片球菌素（Pediocin）、肉食桿菌素（Camobacteriocin）、乳桿菌素（Lactocin）、明串珠菌素（Leuconostocin）、植物乳桿菌素（Plantaricin）、腸球菌素（Enterocin）等[5]。本研究從新疆多地采取牧民自制干酪樣品中分離乳酸菌，用牛津杯法篩選出1株對革蘭氏陽性菌葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌均具有明顯抑制作用的乳酸菌，經排除酸、過氧化氫干擾，胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，仍然具有較好的抑菌活性。研究其生物學特性和抑菌譜，表明此菌株具有較為廣泛的應用價值，為開發安全的食品生物保鮮乳酸菌及其生產應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從新疆伊寧、鞏留、可可托海、昭蘇、那拉提、新源等地隨機采取牧民自制奶制品樣品。

1.1.2 菌種及試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：實驗室保存。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC21600：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

試驗所用試劑均購自天津市巴斯夫化學試劑廠。胰蛋白酶（活性＞250U/mg），胃蛋白酶（活性：3.0～3.5NFU/mg）。

1.1.3 培養基

①LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。②改良MRS培養基[6]：蛋白陳10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.588 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。③分離培養基：Elliker瓊脂培養基、M17培養基、膽汁七葉靈苷疊氮鈉培養基和乳酸桿菌選擇性培養基。

1.2 儀器與設備

5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf儀器公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋：韓國LabTech公司；PHS-3C標準pH計：上海精密科學儀器有限公司；TC-512PCR擴增儀：美國Techne公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統：美國BioRad公司；CX21光學顯微鏡：日本Olympus公司；UVmini-1240紫外分光光度計：日本島津公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；HH-42恒溫水浴鍋：常州國華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌分離

1 g干酪放入裝有100 mL無菌水的三角瓶中→37 ℃搖床振蕩40 min→菌懸液

吸取菌懸液，采用梯度稀釋法涂布于分離培養基上。37 ℃厭氧培養2 d，根據菌落顏色、形態、大小、凸凹等表型差異進行初步分離篩選并純化，所得純培養物轉接到MRS固體培養基上，4 ℃保藏備用。

1.3.2 乳酸菌發酵上清液的制備

將菌株接種到MRS液體培養基中，于30 ℃厭氧培養24 h，離心（10 000 r/min、10 min、4 ℃）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾得到無細胞發酵上清液，于4 ℃保存備用。

1.3.3 指示菌菌懸液的制備

分別挑取已活化的四種指示菌接種于5 mL LB培養基，37 ℃培養24 h，測其濃度，用無菌生理鹽水稀釋成107CFU/mL菌懸液，于4 ℃保存備用。

1.3.4 牛津杯法初篩具有抑菌活性的乳酸菌

將100 μL指示菌菌懸液均勻涂布在LB培養基上，在每個平皿中等距離放置4個牛津杯，其中3個牛津杯中加入200 μL乳酸菌上清液，其余加入等量的MRS培養基作為對照，標注菌株號，于37 ℃培養16 h，觀察抑菌圈。

1.3.5 產細菌素乳酸菌復篩

按照參考文獻進行排除有機酸、過氧化氫試驗及蛋白酶敏感性試驗[7-8]。

1.3.6 產細菌素乳酸菌的鑒定

菌株的細胞形態、菌落形態、革蘭氏染色、生理生化試驗參照文獻[10-11]進行。尿素法提取菌株DNA，PCR擴增并測序，將所測得的16S rDNA序列提交到GenBank數據庫中，用BLAST進行相關序列的比對。

1.3.7 菌株KKTHD13生物學性質的研究

（1）熱穩定性

將KKTHD13發酵上清液在30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃水浴鍋中分別放置培養20 min以及冰浴處理20 min，將未處理發酵上清液作陽性對照，分別測定抑菌活性。

（2）pH穩定性

將KKTHD13發酵上清液用1 mol/L HCl或者1 mol/L NaOH調節pH值2～12，室溫培養2 h，再將pH值調至6.0，測試其抑菌性。

（3）表面活性劑處理

選擇十二烷基硫酸鈉（sodium do decyl sulfate，SDS）、Tween 80、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Triton X-100和尿素（urea）五種表面活性劑，以1 mg/100 mL添加到待測乳酸菌發酵上清液中，置于37 ℃處理5 h。以不添加表面活性劑空白培養基作為陽性對照，檢測其殘余抑菌活性，每個處理做三個平行試驗，取其平均值。

（4）蛋白酶敏感性

為進一步檢測KKTHD13發酵上清液對蛋白酶的敏感性，選取胰蛋白酶和胃蛋白酶對發酵上清液進行處理。先將發酵上清液的pH值調節至各種酶反應的最適pH值，再向發酵上清液中添加各種酶，置于37 ℃培養2 h，再置于沸水浴中滅酶處理5 min。以未經酶處理的發酵上清液中作為陽性對照，檢測其抑菌活性，每個處理做三個平行試驗，取其平均值。

1.3.8 抑菌譜

選定一些常見革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）的致病菌和腐敗菌作為指示菌，測定細菌素的抑菌譜。

2 結果與分析

2.1 產細菌素乳酸菌的篩選結果

以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為指示菌，從分離純化得到的34株乳酸菌中篩選出8株具有抑菌活性的菌株，采用牛津杯法初篩具有抑菌活性的乳酸菌，結果見表1。

表1 抑菌試驗結果Table 1 Results of bacteriostatic test mm

由表1可知，通過酸干擾排除和過氧化氫排除試驗，8株菌產生的抑菌圈直徑都有不同程度的縮小，表明這些乳酸菌所產生的酸和過氧化氫在一定條件下對指示菌具有抑制作用，但是排除酸和過氧化氫作用后抑菌活性仍然存在，證明其抑菌活性并非全部由酸和過氧化氫引起，很有可能是細菌素作用產生的。

鑒于細菌素的蛋白性質，通過酶解試驗來確定乳酸菌對指示菌起抑制作用的物質是否為細菌素。表1中酶解試驗結果表明，經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抑菌圈幾乎消失，菌株所產抑菌物質的抑菌活性明顯下降，可見抑菌物質對蛋白酶較敏感，說明抑菌物質為蛋白質類物質，可初步確定抑菌物質為細菌素。

在本研究中，經過牛津杯法初篩、酸干擾排除試驗和過氧化氫排除試驗，由表1數據可知，菌株KKTHD13抑菌效果最穩定，抑菌活性最好，以下試驗均以菌株KKTHD13作為目標菌株。

2.2 產細菌素的乳酸菌的鑒定

KKTHD13菌株的形態學試驗結果見圖1。由圖1可知，該菌株G+，細胞呈球狀，成對或短鏈狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。菌落直徑約1 mm、乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑。

圖1 KKTHD13菌株形態及革蘭氏染色Fig.1 Colony characteristic and cell morphology of strain KKTHD13

根據東秀珠、蔡妙英《常見細菌系統鑒定手冊》所進行的生理生化試驗，結果見表2。由表2可知，菌株接觸酶試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗及精氨酸試驗均呈陰性，且V-P試驗陽性；耐鹽性試驗表明，菌株生長NaCl含量范圍在0～6%左右，鹽含量＞6%時即停止生長；除了木糖不能利用，其他試驗13種糖及醇都能利用。

綜合以上菌株的特性，對照《伯杰細菌鑒定手冊（第九版）》[9]、《乳酸菌分類鑒定及試驗方法》[10]及《常見細菌系統鑒定手冊》[11]，初步將KKTHD13菌株鑒定為腸球菌屬（Enterococcussp.）。

表2 菌株KKTHD13生理生化試驗Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain KKTHD13

進一步對菌株KKTHD13的16S rRNA基因序列同源性分析并構建系統發育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株KKTHD13隸屬于腸球菌屬（Enterococcussp.），與已知種屎腸球菌（Enterococcus faecium）系統發育關系最近，序列同源性達到99%，同時與腸球菌其他幾個種的親緣關系也較近，其中與蒙氏腸球菌（Enterococcus mundti）的16S rRNA基因序列同源性達到98%，與鳥腸球菌（Enterococcus avium）、蒼黃腸球菌（Enterococcus gilvus）、耐久腸球菌（Ente rococcus durans）、鉛黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）等的同源性也在95%以上，因此依據微生物種鑒定的通用標準[15]，在種水平上不能明確該菌株的系統發育地位，初步確定該菌為腸球菌屬（Enterococcussp.）。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構建KKTHD13系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain KKTHD13 based on 16S rRNA gene partial sequences

2.3 菌株KKTHD13生物學性質的研究

菌株KKTHD13生物學性質研究結果見表3。

表3 熱、p H、酶、表面活性劑對KKTHD13細菌素活性的影響及抑菌譜Table 3 Effect of temperature,p H,enzyme and surfactant on the antibacterial activity of bacteriocin KKTHD13 and its antimicrobial spectrum

由表3可知，隨著處理溫度的升高，細菌素的抑菌活性逐漸降低，但變化不明顯，在121 ℃處理20 min后，基本失去抑菌活性，說明KKTHD13菌株所產生的細菌素具有一定的熱穩定性。

由表3可知，在pH 4.0～6.0的微酸條件下，KKTHD13細菌素的抑菌圈直徑最大，表明具有最強的抑菌活性，相反在pH 3.0時抑菌活性反而下降，pH 2.0時抑菌活性甚至消失，排除酸對細菌素的抑菌活性影響。KKTHD13細菌素的抑菌活性在相對較寬的pH范圍（pH 3.0～9.0）內都很穩定。酶及表面活性劑試驗結果表明，經胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后的發酵上清液完全喪失抑菌活性，說明菌株的發酵上清液中的抑菌物質對蛋白酶比較敏感。菌株KKTHD13產生的細菌素在1 mg/100 mL的SDS、EDTA、Triton X-100、Tween-80存在條件下抑菌活性仍然保持穩定，在尿素（urea）處理后抑菌活性消失。本研究試驗結果與植物乳桿菌素C19[12]、片球菌素ST18[13]的研究結果基本一致。

2.4 菌株KKTH13 細菌素的抑菌譜

利用菌株KKTHD13 產生的細菌素對枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌、產氣腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及部分真菌進行抑菌試驗[14]。結果（表3）可知，菌株KKTHD13細菌素不僅對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，對大腸桿菌、產氣腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有較強的抑制作用，而且對部分真菌也有抑制作用，說明該菌株所產細菌素具有較廣泛的抑菌譜。

3 結論

本試驗從新疆傳統發酵干酪中利用牛津杯法篩選得到一株對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌有較好抑制作用的乳酸菌KKTHD13，鑒定為糞腸球菌屬（Enterococcussp.）。菌株KKTHD13對指示菌沒有抑制作用，其發酵上清液具有較好的抑菌性，說明具有抑菌作用的物質存在于乳酸菌KKTHD13的代謝產物中。排除了酸、過氧化氫的干擾后，KKTHD13的發酵上清液仍然具有較強的抑菌作用，說明其代謝產物中還有其他的抑菌物質。該抑菌物質在酸性條件下穩定，對胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，根據細菌素的定義可知，KKTHD13所產生的抑菌物質為細菌素類物質。KKTHD13的發酵上清液具有較好的熱穩定性。經過1 mg/100 mL 的SDS、EDTA、Triton X-100、Tween-80處理下抑菌活性仍然保持穩定，預期在食品生物保鮮中，在酸性、中性以及弱堿性環境中均具有應用潛能。

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