清熱活血方藥對(duì)類風(fēng)濕患者成纖維樣滑膜細(xì)胞OPG、RANKL、TNF-α及IL-17表達(dá)影響分析

劉彥龍，楊林，劉娟云

(河南科技大學(xué)附屬三門峽市中心醫(yī)院，河南三門峽472000)

清熱活血方藥對(duì)類風(fēng)濕患者成纖維樣滑膜細(xì)胞OPG、RANKL、TNF-α及IL-17表達(dá)影響分析

劉彥龍，楊林，劉娟云

(河南科技大學(xué)附屬三門峽市中心醫(yī)院，河南三門峽472000)

目的:分析清熱活血方藥對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-HFLS)OPG、RANKL、TNF-α、IL-17表達(dá)的影響。方法:采用不同劑量的清熱活血方藥治療85例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，采用ELISA法檢測成纖維樣滑膜細(xì)胞中的OPG、TNF-α及IL-17濃度，Western blot法檢測RANKL蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:A、B、C 3組與對(duì)照組的TNF-α、IL-17水平、RANKL表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.872，P=0.003;F=9.831，P=0.011;F=7.392，P=0.039)，A、B、C 3組高于對(duì)照組，B、C 2組低于A組(P＜0.05)，C組低于B組;A、B、C 3組與對(duì)照組的OPG分泌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.856，P=0.008)，A、B、C 3組高于對(duì)照組，B、C 2組高于A組，C組高于B組。結(jié)論:清熱活血方藥能夠抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達(dá)，促進(jìn)OPG的分泌。

清熱活血方藥;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;成纖維樣滑膜細(xì)胞

中醫(yī)認(rèn)為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于“骨痹”“歷節(jié)風(fēng)”、“鶴膝風(fēng)”等范疇，是慢性、對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征的免疫性疾病［1］，RA以關(guān)節(jié)腫脹、晨僵、疼痛、畸形和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，其反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈。清熱活血方藥以清熱利濕與活血通絡(luò)為治療重點(diǎn)，有效緩解患者關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)功能［2］。現(xiàn)選取2012年4月至2013年10月間來我院接受治療的85例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行調(diào)查，并采用不同劑量的清熱活血方藥進(jìn)行治療，取得了較好的臨床療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年4月至2013年10月我院風(fēng)濕免疫科門診和住院治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者作為本研究的研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)西醫(yī)診斷和中醫(yī)濕熱痹阻、瘀血阻絡(luò)證候診斷的RA患者;年齡在18～65歲;DAS評(píng)分≥3.2分;關(guān)節(jié)功能分級(jí)在I級(jí)、II級(jí)、III級(jí);進(jìn)入研究前1個(gè)月內(nèi)患者未服用任何糖皮質(zhì)激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):孕產(chǎn)婦、哺乳期婦女;合并有心、肝、腎功能障礙者;合并有其他風(fēng)濕類疾病者;合并有其他可能影響本研究結(jié)果疾病類;患者及家屬未簽署知情同意書。符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的共85例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A(低劑量組)、B(中劑量組)、C(高劑量組)3組。另外于同一時(shí)間隨機(jī)抽取50名來我院體檢的正常體檢者作為本研究的對(duì)照組，對(duì)照組與研究組具有可比性。

研究組中A組29例，男16例，女13例;年齡19～64歲，平均年齡(48.3±5.6)歲;病程1.1～8年，平均病程(3.7±1.1)年。B組28例，男14例，女14例;年齡18～65歲，平均年齡(49.1±5.3)歲;病程1.2～7.5年，平均病程(3.5±1.3)年。C組28例，男16例，女12例;年齡19～65歲，平均年齡(48.7±4.9)歲;病程0.9～9年，平均病程(3.8± 1.3)年，3組具有可比性。

1.2 方法

各組連續(xù)治療7 d為1個(gè)療程，共服用2個(gè)療程。所有患者給予清熱活血方藥物，該方由補(bǔ)骨脂、阿膠20 g，黃芪、大棗15 g，雞血藤10 g、黨參8 g，茯苓、熟地黃、桂枝各5 g及炙甘草與木香等多種藥材組成。在混合藥物后加入500 mL水武火加熱，濃縮至200 mL后調(diào)為文火，煎2次后混合，分2次服用。A組患者服用800 ml清熱活血方藥物，B組患者服用100 ml清熱活血方藥物，C組患者增加藥物劑量120 ml。對(duì)照組患者為健康志愿者。所有患者均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取前臂靜脈血，將其送檢分離血清。

1.3 觀察指標(biāo)

分別記錄成纖維樣滑膜細(xì)胞中的OPG、RANKL、TNF-α、IL-17水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，分析采用t檢驗(yàn)和方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組一般情況比較

表1顯示，3組患者的性別、年齡、病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.307，P=0.858;t=12.381，P=0.537;t=7.326，P=0.136)。

表13 組一般情況比較(±s)

表13 組一般情況比較(±s)

組別例數(shù)年齡病程A組性別男女29161348.3±5.63.7±1.1 B組28141449.1±5.33.5±1.3 C組28161248.7±4.93.8±1.3 t/χ20.30712.3817.326 P 0.8580.5370.136

2.2 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-17水平的比較

表2顯示，經(jīng)方差分析，A、B、C 3組與對(duì)照組的TNF-α、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 13.872，P=0.003;F=9.831，P=0.011)，兩兩比較，A、B、C 3組的TNF-α、IL-17水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的TNF-α、IL-17水平低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)。

2.3 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中OPG分泌、RANKL表達(dá)比較

圖1、2，表3顯示，經(jīng)方差分析，A、B、C 3組與對(duì)照組的OPG分泌、RANKL表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.856，P=0.008;F=7.392，P=0.039)，兩兩比較，A、B、C 3組的OPG分泌均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌高于A組(P＜0.05)，C組高于B組(P＜0.01)，A、B、C 3組的RANKL表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)。

表2 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-17水平比較(±s，ng/L)

表2 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-17水平比較(±s，ng/L)

注:4組的TNF-α、IL-17水平經(jīng)方差分析(F=13.872，P=0.003，F(xiàn)= 9.831，P=0.011)，與對(duì)照組比較:※P＜0.05，與A組比較:△P＜0.05，與B組比較:aP＜0.01

組別例數(shù)TNF-αIL-17 A組2943.21±2.16※92.13±1.05※0.0030.011 B組2834.62±2.45※△73.87±0.97※△C組2827.17±1.98※△a67.83±1.22※△a對(duì)照組5025.04±1.7863.21±1.09 F 13.8729.831 P

表3 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中OPG分泌、RANKL表達(dá)的比較(±s，%)

表3 不同組成纖維樣滑膜細(xì)胞中OPG分泌、RANKL表達(dá)的比較(±s，%)

注:4組的OPG分泌、RANKL表達(dá)經(jīng)方差分析(F=9.856，P= 0.008，F(xiàn)=7.392，P=0.039)，與對(duì)照組比較:aP＜0.05，與A組比較:bP＜0.05，與B組比較:cP＜0.01

OPGRANKL 組別例數(shù)A組295.18±2.08a47.51±1.01a0.0080.039 B組289.83±2.64ab44.85±2.68abC組2818.87±3.17abc41.56±3.35abc對(duì)照組503.23±1.0548.33±6.82 F 9.8567.392 P

圖1 OPG分泌情況(A為對(duì)照組，B、C、D分別對(duì)應(yīng)為A、B、C組)

3 討論

類風(fēng)濕疾病屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，其證候?yàn)榛颊哧P(guān)節(jié)出現(xiàn)疼痛、晨僵、腫脹以及屈伸不便［3］。類風(fēng)濕患者還會(huì)出現(xiàn)神疲乏力、頭暈舌淡、脈象細(xì)等癥狀。該疾病主要以肝腎不足、精血虧損以及受風(fēng)寒所引發(fā)。正如《素問·痹論》云:“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。”西醫(yī)認(rèn)為，類風(fēng)濕疾病為關(guān)節(jié)滑膜受損，使得關(guān)節(jié)損壞產(chǎn)生畸形，患者的日常活動(dòng)受到限制［4］。RANKL、TNF-α以及IL-17侵犯患者機(jī)體內(nèi)的關(guān)節(jié)滑膜引起滑膜炎，若患者病程時(shí)間過長，在晚期往往會(huì)導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)異常變形，嚴(yán)重者會(huì)致殘，而其致殘的主要原因便是骨細(xì)胞遭到破壞［5］。有關(guān)文獻(xiàn)指出，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要是指骨侵蝕侵犯機(jī)體的各關(guān)節(jié)滑膜，在早期常常出現(xiàn)患者關(guān)節(jié)疼痛，并伴隨著早期骨細(xì)胞的丟失，若患者病程時(shí)間過長(≥2年)，在晚期往往會(huì)導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)異常變形，這意味著其病理改變進(jìn)入不可逆期進(jìn)而致殘［6］。

圖2 RANKL表達(dá)情況(A為對(duì)照組，B、C、D分別對(duì)應(yīng)為A、B、C組)

經(jīng)有關(guān)文獻(xiàn)記載，在大多數(shù)情況下，患者的體質(zhì)影響著機(jī)體對(duì)某些疾病的易患性和病變過程的傾向性，隨著人們生活水平的提高，大多數(shù)人的體質(zhì)正在逐漸改變，形盛體實(shí)、郁火內(nèi)生、濕熱蘊(yùn)積已成為中醫(yī)常見的體質(zhì)癥狀［7］，而濕熱瘀阻證正是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最主要的特征。清熱活血方藥可以有效地促進(jìn)OPG含量的提升，其因子會(huì)以競爭方式與RANKL受體進(jìn)行結(jié)合。還可以有效地抑制RANKL與RANK受體相結(jié)合，對(duì)破骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生抑制作用，減弱破骨細(xì)胞活化，縮短破骨細(xì)胞存活的周期。對(duì)骨吸收也產(chǎn)生了抑制效果，OPG因子在骨代謝中起到了重要的調(diào)節(jié)作用［8］。該方中的黃芪具有較強(qiáng)的補(bǔ)氣作用，可有效改善患者貧血狀況，增加并調(diào)節(jié)患者機(jī)體內(nèi)的免疫功能，促進(jìn)干擾素系統(tǒng)，提高抗體的抗病能力。黃芪還可以有效抑制細(xì)菌、病毒，降低血小板的黏附力，減少微血栓的形成，通絡(luò)止痛，消除類風(fēng)濕患者關(guān)節(jié)腫痛;熟地黃可以有效地抗血液凝固，增強(qiáng)免疫力，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，改善陰虛癥狀［9］;補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎壯陽、通絡(luò)止痛、補(bǔ)脾健胃的作用;阿膠具有補(bǔ)陰血、益精填髓的效果，促進(jìn)骨組織增長;炙甘草具有益氣作用，有效補(bǔ)充類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者損失掉的能量，促進(jìn)消化，提升患者食欲;大棗性溫，味道甘甜，具有補(bǔ)脾益氣與養(yǎng)血安神的效果，可以有效治療脾虛食少以及乏力等疾病;茯苓含有較多的糖分，具有抗菌、抗病毒的效果，促進(jìn)患者細(xì)胞免疫與體液免疫，提高患者的抗病能力［10］。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，RANKL屬于前體破骨細(xì)胞分化中的重要啟動(dòng)因子。當(dāng)該因子與RANK受體結(jié)合以后，會(huì)發(fā)揮刺激破骨細(xì)胞活化進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、提高破骨細(xì)胞存活的周期，從而抑制破骨細(xì)胞凋亡的作用［11］。清熱活血藥方成分中的黃芪、炙甘草、茯苓、丹參，可以刺激OPG含量的升高，從而達(dá)到清熱解毒、涼血散瘀、順暢關(guān)節(jié)的作用。有關(guān)文獻(xiàn)指出，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的重要細(xì)胞因子還包括IL-17和TNF-α，該因子誘導(dǎo)骨細(xì)胞破壞產(chǎn)生了刺激性。該因子屬于骨質(zhì)吸收與骨質(zhì)破壞中的重要細(xì)胞因子之一［12］。IL-17可以有效增加患者的成骨細(xì)胞，不斷提升間充質(zhì)細(xì)胞RANKL的表達(dá)。可以有效促進(jìn)患者破骨細(xì)胞的分化，對(duì)破骨細(xì)胞前體發(fā)育進(jìn)行刺激，形成成熟的破骨細(xì)胞，對(duì)原有破骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。另外，IL-17還能誘導(dǎo)并協(xié)同TNF-α產(chǎn)生及發(fā)揮其作用［13］。而TNF-α正是導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨破壞的重要因素，TNF-α對(duì)RNAKL產(chǎn)生誘導(dǎo)激活作用，對(duì)破骨細(xì)胞產(chǎn)生增殖與分化作用。該因子與TNF-β發(fā)生有效反應(yīng)，刺激患者形成破骨細(xì)胞，從而參與骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)的破壞［14］。本研究對(duì)患者不同劑量的清熱活血方藥治療，A、B、C 3組的TNF-α、IL-17水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的TNF-α、IL-17水平低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)，且A、B、C 3組的OPG分泌均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌高于A組(P＜0.05)，C組高于B組(P＜0.01);A、B、C 3組的RANKL表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)，說明清熱活血方藥的劑量越高可以有效抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達(dá)，促進(jìn)OPG的分泌［15］。

綜上所述，清熱活血方藥治療類風(fēng)濕具有顯著的臨床療效，全面有效地控制病情進(jìn)展，減少并發(fā)癥的發(fā)生。清熱活血方藥有效抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達(dá)，促進(jìn)OPG的分泌。該方藥減少西藥的副作用，安全性較高，值得在臨床中進(jìn)一步推廣與使用。

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Analysis of Clearing Heat and Activating Blood Prescription Interfering on the OPG，RANKL，TNF-α and IL-17 Expression of Fibroblast Like Synovial Cells of Rheumatoid Arthritis Patients

LIU Yan-long，YANG Lin，LIU Juan-yun
(Sanmenxia central hospital affliated to henan university of science and technology，Sanmenxia 472000，China)

Objective:To analyze the Qing-re Huoxue Recipe on patients with rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells(RA-HFLS)of OPG，RANKL，TNF-α，IL-17 expression.Methods:Different doses of heat and activating blood treating 85 cases of rheumatoid arthritis patients，detect fibroblast-like synovial cells OPG by ELISA，and IL-17 concentrations of TNF-α，the expression of RANKL protein detected by Western blot.Results:A，B，C three groups and the control group TNF-α，IL-17 levels，RANKL expression difference was statistically significant(F=13.872，P= 0.003;F=9.831，P=0.011;F=7.392，P=0.039)，A，B，C three groups higher，B，C groups lower in group A，group C than in group B;A，OPG secretion differences between B，C three groups and the control group was statistically significant(F=9.856，P=0.008)，A，B，C three groups higher，B，C in two high-group A，group C than in group B. Conclusion:Heat activating blood can inhibit RA-HFLS in RANKL，TNF-α expression and IL-17OPG and promote secretion of OPG.

Heat and activating blood;Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synovial cells

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0549-04

2015-02-16

劉彥龍(1972-)，男，河南鄭州人，醫(yī)學(xué)本科，從事中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫性疾病的臨床與研究。