茶園土壤中擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測

劉騰飛， 張 麗， 楊代鳳， 董明輝， 顧俊榮

(1.江蘇太湖地區農業科學研究所，江蘇 蘇州215155; 2.蘇州市職業大學，江蘇 蘇州215104)

擬除蟲菊酯類農藥是一類以神經鈉離子通道為作用靶標的仿生性殺蟲劑，具有廣譜、高效、用量少、成本低等特點，在農業生產和衛生領域廣泛使用［1］。但此類農藥對環境非靶生物蜜蜂、家蠶和魚類等水生生物高毒［2-3］，有些品種具有“三致”作用［4］，長期接觸可造成慢性蓄積中毒［5］，并誘發慢性疾病［6-7］。此外，它具有潛在的環境雌激素活性［8］和一定的生殖毒性［9-10］，可損害哺乳動物的生殖系統和影響生殖激素水平，并對免疫、心血管、神經系統存在毒副作用［11-12］。世界上許多國家對擬除蟲菊酯類農藥的殘留限量都作了嚴格的規定。雖然擬除蟲菊酯類農藥殘留期較短［13］，但有些品種對光熱穩定，在自然條件下降解慢，進入土壤環境會產生一定累積，造成土壤擬除蟲菊酯類農藥污染，并通過徑流、淋溶等途徑污染水體，最終危害人體健康。因此建立快速、簡便的方法來準確測定土壤中此類農藥，對保護土壤環境和人畜健康具有重要意義。

目前，對于土壤中擬除蟲菊酯類農藥的殘留分析，采用的樣品提取方法主要為傳統的索氏提取法［14］、振蕩提取法［15-17］和加速溶劑萃取法［18］; 凈化方法多采用液液分配凈化［17］、固相萃取凈化［19-20］和柱層析凈化［14，16，21］，也有采用磺化法凈化［22］。這些前處理方法溶劑用量大、操作繁瑣、耗費時間，有的萃取過程需要昂貴的儀器設備，檢測成本高，難以在普通實驗室推廣使用。分散固相萃取( Dispersive solid phase extraction，DSPE) 是2003 年美國農業部Anastassiades 等人［23］開發的一種新型農藥殘留樣品制備技術，該技術利用在樣品提取液中充分渦旋地分散吸附填料，將基質中的色素、脂肪、糖類、有機酸等雜質除去，從而實現復雜樣品中農藥殘留快速、高效、經濟的測定，目前已廣泛應用于水果、蔬菜農藥殘留的檢測［24-25］，但在土壤中的應用報道較少。本研究擬將DSPE 方法用于土壤樣品前處理，結合氣相色譜-電子捕獲法( GC-ECD) ，以期建立土壤中甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯7 種擬除蟲菊酯類農藥殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

7890A 氣相色譜儀，配有電子捕獲檢測器( ECD) 、7693 自動進樣器和Chemstation 色譜工作站( 美國Agilent 公司生產) ;KQ-500DE 超聲波清洗器( 昆山超聲儀器公司生產) ;TG16-WS 臺式高速離心機( 湖南湘儀實驗儀器公司生產) ;HSC-24 B 氮吹儀( 天津恒奧科技公司生產) ; VM-10 渦旋振蕩器( 韓國Daihan Scientific 公司) ; SX2-4-10 馬弗爐( 上海躍進醫療器械公司生產) ; Direct-Q 5 UV 型超純水機( 美國Millipore 公司生產) 。

1.2 藥品與試劑

甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯，質量濃度均為1 000 mg/L，購于農業部環境保護科研監測所;正己烷，HPLC 級( 瑞典Oceanpak 公司生產) ; 乙二胺-N-丙基硅烷( PSA) ，粒度40 ～60 μm( 美國Agela Technologies 公司生產) ;十八烷基硅烷鍵合硅膠( C18) ，粒度40 ～60 μm( 美國Sepax Technologies 公司生產) ;乙腈、乙酸、無水乙酸鈉、無水硫酸鎂(620 ℃灼燒4 h) 均為分析純( 上海國藥集團化學試劑有限公司生產) ;實驗用水為超純水(18.4 MΩ) 。

1.3 供試土壤

供試土壤為黃壤土，采自蘇州東洞庭山茶園，每個土樣采取多點取樣法(5 ～10 點) 采集表層(0 ～15 cm) 土壤。將土樣除去草根、石塊等雜物，搗碎，充分混合均勻，用四分法取一定量備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理 提取:準確稱取5.00 g 土壤樣品，置于50.00 ml 聚四氟乙烯離心管中，加入2.00 ml超純水，渦旋混勻，浸潤15.0 min，加入10.00 ml 乙酸-乙腈溶液( 體積比1∶ 99) ，混勻，超聲提取15.0 min，加入2.00 g 無水乙酸鈉和2.00 g 無水硫酸鎂，渦旋2.0 min，以9 000 r/min轉速離心4 min，取上清液待用。凈化:采用DSPE 方法凈化，另取一支10.00 ml 聚四氟乙烯離心管，加入0.15 g C18、0.15 g PSA和0.30 g 無水硫酸鎂，加入4.00 ml 上清液，渦旋2.0 min，以9 000 r/min轉速離心5.0 min。移取2.00 ml上清液，在50 ℃水浴下用氮氣緩慢吹至近干，定量加入1.00 ml 正己烷溶解，在混合器上混勻，過0.22 μm有機系濾膜，凈化液待測。

1.4.2 GC-ECD 色譜條件 毛細管色譜柱: HP-5(30 m×0.32 mm× 0.25 μm) ; 柱升溫程序: 初溫80 ℃，保持0.3 min，30 ℃/min 升至180 ℃，保持5.0 min，20 ℃/min升至260 ℃，保持23.0 min;檢測器溫度: 300 ℃; 進樣口溫度: 220 ℃，隔墊吹掃3 ml/min; 載氣: 氮氣，純度≥99.999%，流速1 ml/min;尾吹氣: 高純氮氣，60 ml/min; 進樣量:1.0 μl，不分流進樣。

1.4.3 線性試驗 分別移取1 000 mg/L 的7 種菊酯類農藥標準品1.00 ml 置于10.00 ml 容量瓶中，用正己烷定容，配成質量濃度為100 mg/L的單標溶液。根據各農藥在ECD 檢測器上的峰高響應，取高效氯氟氰菊酯單標溶液0.10 ml，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯單標溶液各0.25 ml，其余擬除蟲菊酯類農藥單標溶液各0.50 ml 于10.00 ml 容量瓶中，用正己烷定容至刻度，得7 種擬除蟲菊酯類農藥混合標準儲備液，保存于4 ℃冰箱中。

取空白土壤試樣的凈化液作為溶劑，配制基質匹配系列標準溶液，高效氯氟氰菊酯質量濃度為0.004 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.100 mg/L、0.200 mg/L、0.400 mg/L，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯質量濃度分別為0.010 mg/L、0.025 mg/L、0.050 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L、1.000 mg/L，氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯質量濃度分別為0.020 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L、1.000 mg/L、2.000 mg/L。采用GC-ECD 測定各待測農藥的峰面積，以標準溶液的質量濃度( x) 為橫坐標，峰面積響應值( Y) 為縱坐標，繪制各擬除蟲菊酯類農藥的基質標準曲線，得出回歸方程。

1.4.4 添加回收試驗 稱取5.0 g 空白土壤樣品3份，分別加入50.0 μl、200.0 μl、500.0 μl 上述7 種擬除蟲菊酯類農藥混合標準儲備液( 高效氯氟氰菊酯的添加水平分別相當于0.100 mg/kg、0.040 mg/kg、0.010 mg/kg，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯的添加水平分別相當于0.250 mg/kg、0.100 mg/kg、0.025 mg/kg，氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯的添加水平分別相當于0.500 mg/kg、0.200 mg/kg、0.050 mg/kg) ，充分混勻，靜置1 h，按照方法1.4.1提取與凈化后采用GC-ECD 法測定各農藥的峰面積，對每個添加水平作3 個平行，計算回收率及相對標準偏差。

1.4.5 定性和定量 準確吸取1.0 μl 樣品溶液進樣，記錄色譜峰保留時間和峰面積。再吸取1.0 μl基質匹配標準液進樣，記錄保留時間和峰面積，以保留時間定性，基質外標法定量，對含有2 個及2 個以上異構體的擬除蟲菊酯類農藥，以各異構體的峰面積之和計算農藥殘留量( ω) 。

計算公式:ω=( ρ ×v ×f) /m，式中ω 為待測樣品中農藥殘留量( mg/kg) ，ρ 為樣液中待測農藥殘留量( mg/L) ，m 為稱取的樣品量( g) ，v 為定容體積( ml) ，f 為稀釋倍數。

1.4.6 樣品測定 用建立的方法檢測16 份采自蘇州東洞庭山茶園土壤樣品。

2 結果與分析

2.1 7 種擬除蟲菊酯類農藥的GC-ECD 色譜圖

7 種擬除蟲菊酯類農藥的溶劑標準溶液、基質匹配標準溶液色譜圖見圖1，空白樣品及樣品加標色譜圖見圖2。從圖中可以看出，7 種擬除蟲菊酯類農藥的色譜分離效果較好，在標準組分出峰處無明顯的干擾雜峰，說明本研究設置的前處理條件及色譜條件合適。

圖1 標準溶液色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of standard solution(A) and matrix-matehed standard solution(B) of seven pyrethroid pesticides

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of blank soil sample(A) and spiked soil sample(B)

2.2 7 種擬除蟲菊酯類農藥的線性回歸方程

對質量濃度為0.004 ～2.000 mg/L的7 種擬除蟲菊酯類農藥基質匹配標準溶液進行GC-ECD 測定，以峰面積( Y) 對質量濃度( x) 進行回歸，結果見表1。可以看出，各農藥濃度與峰面積均呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999，表明DSPE 結合GC-ECD 法適用于土壤中7 種菊酯類農藥的定量分析。

表1 7 種擬除蟲菊酯類農藥的線性回歸方程和相關系數Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients for seven pyrethroid pesticides

2.3 7 種擬除蟲菊酯類農藥的回收率

從表2 可以看出，當添加水平為0.01 ～0.50 mg/kg時，7 種擬除蟲菊酯類農藥在土壤中的平均回收率為91.6% ～100.3%，相對標準偏差( RSD) 為1.3% ～9.8%，表明該方法具有很好的準確性和重復性，符合農藥殘留檢測的要求。

2.4 7 種擬除蟲菊酯類農藥的檢出限與定量限

對7 種擬除蟲菊酯類農藥最低添加水平的土壤樣品進行測定，得到色譜圖。分別以色譜圖中噪音信號的3 倍和10 倍計算出甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯的檢出限( LOD) 分別為0.003 1 mg/kg、0.001 8 mg/kg、0.008 8 mg/kg、0.004 3 mg/kg、0.008 7 mg/kg、0.008 1 mg/kg、0.006 6 mg/kg，定 量 限( LOQ) 分 別 為0.010 0 mg/kg、0.005 8 mg/kg、0.029 0 mg/kg、0.015 0 mg/kg、0.029 0 mg/kg、0.027 0 mg/kg、0.022 0 mg/kg。

2.5 樣品測定

將建立的分析方法應用于蘇州東洞庭山茶園土壤樣品檢測。結果顯示，在16 份土壤樣品中，共檢出4 份土壤樣品含有高效氯氟氰菊酯，含量分別為0.010 7 mg/kg、0.007 5 mg/kg、0.013 4 mg/kg、0.008 6 mg/kg;1 份土壤樣品含有氟氯氰菊酯，含量為0.038 0 mg/kg。其他樣品未檢測到7 種擬除蟲菊酯類農藥。

表2 7 種擬除蟲菊酯類農藥在土壤樣品中的加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of seven pyrethroid pesticides in soil samples(n=3)

3 討論

3.1 提取條件的選擇

由于土壤水分含量低，本研究試驗前在5.0 g土壤中加入2.00 ml 超純水浸潤，增大樣品的孔徑，從而易于提取溶劑的滲入，提高提取效率。目前從土壤中提取擬除蟲菊酯類農藥殘留，常用的溶劑主要有乙腈、丙酮、乙酸乙酯以及不同溶劑的組合等［14-22］。與丙酮、乙酸乙酯等相比，乙腈滲透性強，對各種極性農藥溶解度大［26］，提取效率高，且對基質中的蠟類、脂肪等非極性成分提取能力弱，能夠有效減少提取液中雜質，因此選擇乙腈作為提取溶劑。由于擬除蟲菊酯類農藥在酸性條件下比較穩定，在提取溶劑中添加適量乙酸，能夠提高目標農藥在提取劑中的溶解度和穩定性，使用乙酸-乙腈溶液( 體積比1∶ 99) 提取的農藥平均回收率高，且平行性較好。另外，確定乙酸-乙腈溶液( 體積比1∶ 99) 用量為10 ml，即體積相當于2 倍量的樣品質量，既能保證農藥的充分提取，又節省試劑，減少環境污染。

超聲波提取操作簡單，所需時間短，可實現批量樣品的同時處理，但超聲波在提取過程中會產生熱量，過長的超聲時間可能會造成擬除蟲菊酯類農藥分解，降低靈敏度，影響回收率，因此試驗前期比較了5 ～20 min 的超聲時間對土壤添加7 種擬除蟲菊酯類農藥的提取效果。結果顯示，超聲時間為10 ～20 min 時7 種擬除蟲菊酯類農藥的平均回收率均在87%以上，為確保提取充分，本試驗選擇超聲時間為15 min。

3.2 凈化條件的選擇

采用DSPE 凈化方法，簡單、快速、經濟，既可以省去裝柱、過柱及大量溶劑洗脫等步驟，實現樣品的快速制備，同時也降低了待測農藥損失的可能性，使檢測結果更接近真實值。PSA 可以有效去除土壤中糖類、脂肪酸、金屬離子、極性色素等干擾物質，而C18 去除土壤中維生素、甾醇、油脂和弱極性色素的能力較強，且對目標物質的吸附作用小，因此選用PSA 和C18 2 種混合吸附劑進行分散固相萃取凈化。試驗前期比較了20 ～250 mg PSA 和20 ～250 mg C18 的凈化效果及對目標農藥回收率的影響，發現當PSA 和C18 用量低于150 mg 時，對7 種擬除蟲菊酯類農藥幾乎沒有干擾，回收率均在90%以上。為最大程度地凈化樣品提取液并保證回收率，本試驗選擇PSA 和C18 用量均為150 mg。

3.3 基質效應

基質效應［27］是指樣品基質中的某些共提取物組分對待測物測定值的影響。在農藥殘留的色譜分析中，大多數農藥表現出不同程度的基質增強效應［28］，即相同濃度的農藥在基質中的響應值比其在純溶劑中的高，一般認為是樣品中基質成分的存在減少了色譜系統活性位點與待測物分子作用的機會，使得待測物檢測信號增強。本試驗結果顯示，除了甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯的基質效應不明顯外，其他5 種擬除蟲菊酯類農藥都存在不同程度的基質增強效應。故在用外標法定量時，采用空白土壤凈化液配制待測農藥的標樣，以消除基質干擾，減少誤差。

3.4 茶園土壤中菊酯類農藥的殘留狀況

供試土壤樣品的檢測結果顯示，被檢茶園土壤中存在一定的擬除蟲菊酯類農藥殘留，殘留物主要為高效氯氟氰菊酯和氟氯氰菊酯。由于目前中國沒有制定擬除蟲菊酯類農藥在土壤中的殘留限量標準，因此，無法判定此類農藥在土壤中的殘留超標情況及土壤環境等級。如以《土壤環境質量標準》( GB15618-1995)［29］中有機氯農藥殘留量為參考，被檢茶園土壤中的擬除蟲菊酯類農藥殘留量不高，低于土壤環境質量一級標準( ≤0.05 mg/kg) 。但是，擬除蟲菊酯類農藥因其脂溶性強而長期吸附于土壤中，造成土壤環境污染，因此在環境中的殘留問題應引起重視。同時，在茶園使用此類農藥時，應遵守良好的農業操作規范，嚴格按照推薦劑量和次數使用，并注意其使用方法。

［1］ 黃 臻，朱 慶.衛生用擬除蟲菊酯殺蟲劑的開發與應用［J］.上海農業學報，2003，19(1) :71-75.

［2］ 孫克坊，周 勤，周金錢，等.微量菊酯類農藥對家蠶毒性的調查初報［J］.蠶桑通報，2002，33(3) :27-29.

［3］ 謝 濤，熊 麗，王 奎，等.擬除蟲菊酯類殺蟲劑對魚類的毒性研究［J］.生物學教學，2005，30(7) :47-49.

［4］ 徐 斐，趙 潔，曹 慧，等.擬除蟲菊酯類農藥的酶水解研究進展［J］.東北農業大學學報，2012，43(7) :1-5.

［5］ 柳榮軍，孫建輝.擬除蟲菊酯類農藥中毒61 例［J］. 實用醫藥雜志，2014，31(8) :766.

［6］ SINHA G，AGRAWAL A K，ISLAM F，et al. Mosquito repellent( pyrethroid-based) induced dysfunction of blood-brain barrier permeability in developing brain［J］. International Journal of Developmental Neuroscience，2004，22 (1) : 31-37.

［7］ KOLACZINSKI J H，CURTIS C F. Chronic illness as a result of low-level exposure to synthetic pyrethroid insecticides: a review of the debate［J］. Food and Chemical Toxicology，2004，42 ( 5) :697-706.

［8］ 邴 欣，汝少國.四種擬除蟲菊酯類農藥的環境雌激素活性研究［J］.中國環境科學，2009，29(2) :152-156.

［9］ FARAG A T，GODA N F，SHAABAN N A，et al. Effects of oral exposure of synthetic pyrethroid，cypermethrin on the behavior of F1-progeny in mice［J］. Reproductive Toxicology，2007，23( 4) :560-567.

［10］ RODRIGUEZA H，TAMAYOA C，INOSTROZA J，et al. Cypermethrin effects on the adult mice seminal glands［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2009，72(2) : 658-662.

［11］ 秦文秀，顏冬云，劉艷秦，等.鹵素擬除蟲菊酯毒理學研究進展［J］.農藥，2009，48(6) :394-398.

［12］ BABINA K，DOLLARD M，PILOTTO L，et al. Environmental exposure to organophosphorus and pyrethroid pesticides in South Australian preschool children: a cross sectional study［J］. Environment International，2012，48(1) :109-120.

［13］ 李玲玉，劉 艷，顏冬云，等.擬除蟲菊酯類農藥的降解與代謝研究進展［J］.環境科學與技術，2010，33(4) :65-71.

［14］ 何基伍，楊婷婷，楊云秋，等.土壤中聯苯菊酯樣品不同制備方法比較研究［J］.現代農業科技，2014 (21) :119-120.

［15］ 謝湘云，沈愛斯，葉江雷，等.固相萃取小柱凈化-氣相色譜法測定土壤和沉積物中有機氯和擬除蟲菊酯農藥殘留［J］.環境化學，2006，25(3) :347-350.

［16］ 陳 莉，章鋼婭，靳 偉，等.土壤中擬除蟲菊酯類殘留農藥的氣相色譜測定方法研究［J］.土壤學報，2006，43(5) :764-771.

［17］ 趙 亮，龔道新，方 平，等.菜地土壤中3 種擬除蟲菊酯類農藥的多殘留分析［J］.農藥，2013，52(2) :114-115.

［18］ 李 俊，肖雅雯，王 震，等.加速溶劑萃取-氣相色譜/質譜法同時測定土壤中擬除蟲菊酯類等18 種農藥殘留［J］. 巖礦測試，2011，30 (5) :590-595.

［19］ 買光熙，李衛建，劉瀟威，等.土壤中有機氯及擬除蟲菊酯類農藥的多殘留分析技術［J］.農業環境與發展，2006(6) :63-66.

［20］ 張志勇，余向陽，王冬蘭，等.水和土壤中3 種擬除蟲菊酯類農藥殘留的分析方法［J］.江蘇農業學報，2009，25(2) :416-420.

［21］ 尹可鎖，張雪燕，徐漢虹，等.滇池周邊農田中擬除蟲菊酯農藥殘留研究［J］.西南農業學報，2011，24(4) :1367-1371.

［22］ 吳 萍，施海燕，韓志華，等.濃硫酸純化-氣相色譜法測定土壤中擬除蟲菊酯農藥殘留［J］.土壤，2008，40(5) :744-749.

［23］ ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and‘dispersive solid-phase extraction’for the determination of pesticide residues in produce［J］. Journal of AOAC International，2003，86(2) : 412-431.

［24］ CIES'LIK E，SADOWSKA-ROCIEK A，RUIZ J M M，et al. Evaluation of QuEChERS method for the determination of organochlorine pesticide residues in selected groups of fruits［J］. Food Chemistry，2011，125(2) : 773-778.

［25］ 易江華，段振娟，方國臻，等. QuEChERS 方法在食品農獸藥殘留檢測中的應用［J］.中國食品學報，2013，13(2) :153-158.

［26］ MA?TOVSKá K，LEHOTAY S J. Evaluation of common organic solvents for gas chromatographic analysis and stability of multiclass pesticide residues［J］. Journal of Chromatography A，2004，1040(2) : 259-272.

［27］ POOLE C F. Matrix-induced response enhancement in pesticide residue analysis by gas chromatography［J］. Journal of Chromatography A，2007，1158(1-2) : 241-250.

［28］ 賀利民，劉祥國，曾振靈. 氣相色譜分析農藥殘留的基質效應及其解決方法［J］.色譜，2008，26(1) :98-104.

［29］ GB15618-1995 土壤環境質量標準［S］.