聚丙烯酸功能化LaF3:Ce3 + /Tb3 +熒光探針測定鮭魚精DNA

張藝，李紫薇，高紅艷

(伊犁師范學院 化學與生物科學學院 新疆凝聚態相變與微結構實驗室，新疆 伊寧 835000)

目前，常用的化學分析方法［1］有色譜分析法、電化學分析法等，但色譜分析法對檢測人員的技術要求較高，需要較大的設備投入、成本高、操作耗時等。電化學分析法的靈敏度、選擇性較差。所以迫切需要發展高靈敏度、選擇性好、方便操作和低成本的分析方法。熒光分析法可以滿足上述要求，而成為較活躍的檢測手段［2］。傳統的熒光材料有有機染料、熒光蛋白、量子點等，但它們大都存在光漂白、信號強度低、穩定性差、低毒等缺點，限制了其在生物和環境檢測領域的深入應用。所以尋找低毒性、良好化學穩定性、高熒光量子產率的新型熒光材料十分必要。

功能化的稀土發光材料在生物和環境檢測領域的應用是利用材料表面的特征官能團(氨基、羧基、巰基等)與待測物質間的能量轉移或生成新的熒光物質而建立起來的熒光淬滅或熒光增強的機理［3-5］。李丹［6］用巰基乙酸(TGA)為表面活性劑與油胺中合成的NaYF4納米晶進行配體交換，利用巰基與稀土Y3+配位，另一端的羧基可以增強其水溶性，并使發光納米材料具有生物活性，最后采用MTT 比色法對肝癌細胞進行了毒性分析。

本文是采用簡單易操作的溶劑熱法制備出LaF3:Ce3+/Tb3+材料，并用聚丙烯酸(PAA)對發光材料進行功能化，使LaF3:Ce3+/Tb3+表面包裹上生物相容性官能團羧基(─COOH)，基于DNA 對COOH-LaF3:Ce3+/Tb3+材料的熒光猝滅作用，定量分析了鮭魚精DNA(hs-DAN)，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

La (NO3)3· 6H2O、Tb (NO3)3· 6H2O、Ce(NO3)3·6H2O、Na2HPO4、NaH2PO4、CH3CH2OH、HOCH2CH2OH、NaF 均為分析純;鮭魚精DNA，標準品;實驗用水為二次蒸餾水。

CYIYE-QI 型移液器;FA2104N 型電子天平;79-1 型磁力加熱攪拌器;pHSJ-5 型pH 計;GZX-9146MBE 型數顯鼓風干燥箱;TGL-16C 型高速臺式離心機;XRD-6000 型X-射線粉末衍射儀;LS-55 型熒光分光光度計;Prestige-21 型紅外光譜儀(KBr 壓片)。

1.2 LaF3:Ce3+ /Tb3+材料的制備

攪拌條件下，在10 mL 乙二醇和20.00 mL 無水乙醇的混合溶劑中分別加入0.9 mL 的La(NO3)3·6H2O、50 μL Tb(NO3)3·6H2O 和50 μL Ce(NO3)3·6H2O。攪拌均勻后，逐滴加入2 mL NaF 水溶液，再繼續攪拌30 min。然后轉移至帶聚四氟乙烯內襯的不銹鋼反應釜中，將其放入烘箱，160 ℃條件下加熱12 h。反應結束后，待溫度降到室溫，倒去反應釜里上清液，釜底的白色固體就是LaF3:Ce3+/Tb3+沉淀，將其分散在水中，轉速為8 000 r/min，離心8 min，同樣的方法用蒸餾水洗滌3 次，除去殘留的溶劑，80 ℃烘干樣品，備用。

1.3 聚丙烯酸(PAA)對LaF3:Ce3+ /Tb3+材料的包裹

稱取0. 112 8 g LaF3:Ce3+/Tb3+樣品，加到20 mL 無水乙醇和10 mL 蒸餾水混合溶液中，再加入1 mL 聚丙烯酸，超聲48 h 后，得到PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+功能材料。用去離子水離心清洗3 次，離心清洗后的樣品超聲分散在50 mL 去離子水中，樣品濃度為0.011 52 mol/L(以LaF3的物質的量濃度計算)，備用。

1.4 PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+功能材料測定鮭魚精DNA

在10 mL 容量瓶中分別加1 mL PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+(0.011 52 mol/L)樣品，5 mL 蒸餾水，再分別加0，60，100，500，1 000，2 500 μL 的100 μg/mL鮭魚精DNA 水溶液，用PBS 緩沖溶液調pH 為5.5，最后用蒸餾水定容至10 mL(樣品濃度為1. 1 ×10－3mol/L)。用熒光分光光度計測其熒光強度，以275 nm 為激發波長，531 nm 為發射波長。PAALaF3:Ce3+/Tb3+制備及與DNA 作用見圖1。

圖1 PAA 包裹LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體及與DNA作用示意圖Fig.1 Schematic illustration of PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+ and detection for hs-DNA

2 結果與討論

2.1 LaF3:Ce3+ /Tb3+納米晶的XRD 表征

圖2 為制備的LaF3:Ce3+/Tb3+晶體的X 射線衍射圖譜。

圖2 LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體的XRD 圖Fig.2 X-ray diffraction patterns of LaF3:Ce3+ /Tb3+ crystals

由圖2 可知，譜圖的衍射峰分別對應(110)、(111)、(112)、(113)、(212)、(220)、(310)、(320)、(115)、(411)、(403)、(314)等晶面。其衍射峰與標準卡片號為72-1435 立方相的LaF3晶體相符合，無明顯雜質峰，說明純度高、結晶好。

2.2 紅外譜圖分析

圖3 給出了PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+晶體紅外吸收譜圖。

由圖3 可知，3 440 cm－1處吸收峰對應著─COOH 基的νO─H峰，2 954 cm－1為PAA 中飽和烷烴─CH2的特征峰，1 726 cm－1處吸收峰是─COOH 基中的特征峰，在1 577 cm－1和1 464 cm－1兩峰為─COOH 基中ν─COO的對稱和不對稱伸縮振動峰。1 429 cm－1為νC─O特征峰，說明聚丙烯酸中的─COOH 與La 發生了鍵合。由此，可以確定聚丙烯酸已成功修飾于LaF3:Ce3+/Tb3+晶體外表面上。

圖3 PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+晶體的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of PAA-LaF3:Ce3+ /Tb3+ crystals

2.3 鮭魚精DNA(hs-DNA)的測定

鮭魚精DNA(hs-DNA)的測定結果見圖4，譜線a ～f 給出了不同摩爾濃度hs-DNA 存在時，體系熒光強度的變化。結果表明，pH =5.5，λem/λex=531/275 nm 時，體系的熒光強度隨hs-DNA 濃度的增加呈線性降低。a ～f 分別是hs-DNA 濃度為0.0，0.6，1.0，5.0，10.0，25.0 μg/mL，LaF3:Ce3+/Tb3+濃度為1.92 ×10－3mol/L 的熒光譜圖。下圖為PAALaF3:Ce3+/Tb3+熒光強度與hs-DNA 濃度之間的線性關系。

圖4 hs-DNA 體系熒光光譜Fig.4 Luminescent spectra of hs-DNA system

由圖4 可知，在濃度為0.6 ～25 μg/mL 范圍內，ΔF 與hs-DNA 濃度呈良好的線性關系，線性方程ΔF =113.9－1.5c，檢測限為0.97 μg/mL，RSD為0.97%。相關系數R=0.998 2。寬的線性范圍、低的檢測限表明此種方法對DNA 的定量分析效果良好。hs-DNA 之所以對PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+材料有熒光猝滅現象，是因為功能化的材料表面有羧基可以與核酸上的氨基鍵合，然后Tb3+或Ce3+的激發電子與DNA 之間的傳遞而導致體系發生熒光猝滅［7］。

2.4 pH 值的選擇

考察了pH 3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5 八種不同緩沖溶液對體系熒光強度的影響，結果見圖5。在10 mL 容量瓶中分別加1 mL PAALaF3:Ce3+/Tb3+樣品(濃度為1. 1 ×10－3mol/L)，1 mL 鮭魚精DNA，用PBS 緩沖溶液調pH 值，最后蒸餾水定容。

圖5 酸度對體系熒光強度的影響Fig.5 Effect of pH on the quenching of the fluorescence

由圖5 可知，體系的熒光強度隨pH 值的增加略有增強，pH 5.5 時，熒光最強，當pH 值＞5.5 時，體系的熒光強度反而降低。故本實驗選擇pH 5.5時測定體系。

2.5 共存物的干擾

考察了當hs-DNA 濃度為5.0 μg/mL 時，不同濃度的干擾物質對測定的影響，見表1。

表1 共存物質對測定的干擾Table 1 Tests for the interference of coexisting substances

由表1 可知，大部分共存物質對hs-DNA 的分析的干擾都很小。表明該方法有較好的選擇性。

3 結論

用簡單的溶劑熱方法制備了LaF3:Ce3+/Tb3+晶體，利用超聲微乳包裹技術將聚丙烯酸包裹在LaF3:Ce3+/Tb3+材料表面，合成出羧基功能化的PAA-LaF3:Ce3+/Tb3+材料。這樣增大了材料的水溶性及生物相容性，據此建立了與鮭魚精DNA 之間的熒光探針，利用熒光猝滅法，對核酸進行了定量測定，靈敏度和選擇性較好。該方法可以用于生物樣品的測定。參考文獻:

［1］ 高鴻. 分析化學前沿［M］. 北京:科學出版社，1999:370.

［2］ 王歡，高奕紅，張萍.熒光傳感器及其分子識別作用的研究進展［J］.應用化工，2014，43(4):718-728.

［3］ Wang L Y，Yan R X，Hou Z Y，et al. Fluorescence resonant energy transfer biosensors based on upconversion luminescent nanoparticles［J］. Angew Chem Int Ed，2005，44:6054-6057.

［4］ Chen Hongqi，Yuan Fei，Xu Yong，et al.Simple and sensitive detection method for cobalt(Ⅱ)in water using CePO4:Tb3+nanocrystals as fluorescent probes［J］.Spectrochimica Acta Part A，2013，107:151-155.

［5］ Liu J N，Bu W B，Pan L M，et al.NIR-triggered anticancer drug delivery by upconverting nanoparticles with integrated azobenzene-modified mesoporous silica［J］. Angewandte Chemie，2013，125:4471-4475.

［6］ 李丹.巰基乙酸修飾對六角相NaYF4:Yb，Er 上轉換發光納米材料的影響［D］.長春:吉林大學，2010.

［7］ Dong Ling，Yang Z H，Zhang Y，et al. Novel luminescent nanoparticles for DNA detection［J］.Spectrochimica Acta Part A，2010，75:1530-1534.