七氟醚對幼鼠獲取空間學習記憶能力及海馬pERK1/2表達的影響

劉艷軍，余相地，湯和青，袁華平，陳 春

（三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院麻醉科，湖北 宜昌 443003）

七氟醚對幼鼠獲取空間學習記憶能力及海馬pERK1/2表達的影響

劉艷軍，余相地，湯和青，袁華平，陳 春

（三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院麻醉科，湖北 宜昌 443003）

目的 探討七氟醚對幼鼠獲取空間學習記憶能力及海馬pERK1/2表達的影響。方法出生后14 d SD幼鼠54只，隨機分為對照組(C組)、七氟醚5%組(Sevo組)、假手術(shù)組(Sham組)各18只。C組不做任何處理，Sevo組幼鼠暴露于5%的七氟醚4 h，Sham組幼鼠吸入氧氣4 h，1周、3周、6周后于上午8:00～11:00應用Morris水迷宮對幼鼠進行7 d的行為學觀察，記錄逃避潛伏期，行為學結(jié)束后隨即取出6只幼鼠用免疫組化法測定海馬CA1區(qū)神經(jīng)元pERK1/2的表達。結(jié)果與Sham組比較，Sevo組逃避潛伏期和探索時間明顯延長(P＜0.01)，Sevo組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元pERK1/2的表達明顯減少(P＜0.01)；Sham組與C組逃避潛伏期時間差異無統(tǒng)計學意義，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元pERK1/2的表達之間差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論七氟醚對幼鼠獲取空間學習記憶能力的影響與抑制海馬pERK1/2表達有關(guān)。

七氟醚；海馬；pERK1/2；空間學習；記憶能力

七氟烷廣泛用于小兒吸入麻醉誘導，無刺激性，血(氣)分配系數(shù)低，麻醉誘導迅速平穩(wěn)，蘇醒快，麻醉深度易于調(diào)控；但有研究發(fā)現(xiàn)暴露于麻醉藥的新生動物會導致發(fā)育中的神經(jīng)元凋亡，影響其以后的記憶和學習能力，因此研究七氟醚對幼鼠獲取空間學習記憶能力的影響及機理有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、模型建立及分組 出生后14 d SD幼鼠54只，隨機分為對照組(C)、七氟醚5%組(Sevo組)、假手術(shù)組(Sham組)各18只。C組不做任何處理，Sevo組大鼠用特制面罩吸入七氟醚后行頸正中氣管切開插管，接小動物呼吸機輔助呼吸，將七氟醚用輸液微量泵泵入吸入氣路中，通過麻醉氣體檢測儀持續(xù)測定，調(diào)整泵速，維持呼氣末七氟醚濃度在5最低肺泡有效濃度(MAC)值；Sham組行頸正中氣管切開插管，接小動物呼吸機輔助呼吸，吸入空氣。

1.2 行為學測定 實驗時將大鼠從4個不同的入水點面向池壁放入水中，水迷宮的圖像自動監(jiān)視系統(tǒng)追蹤大鼠的游泳軌跡(時間≤120 s)，并記錄大鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期，Escape latency)，找到后允許動物在平臺上停留30 s；如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，讓其在平臺停留30 s，再進行下次實驗。以逃避潛伏期作為觀測指標，120 s內(nèi)未找到平臺者記為120 s。每7 d成績的平均值為當日成績。測試過程中保持實驗室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，水溫保持在(25±1)℃，以排除干擾因素。

1.3 免疫組織化學測定 Ⅱ套切片采用SP法測定大鼠海馬神經(jīng)元pERK1/2的表達，切片依次脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10 min，三蒸水洗5 min×3次。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.14)浸泡5 min，高壓修復3 min，自然冷卻至室溫。三蒸水洗5 min×3次，滴加1:100 pERK1/2抗體，放入4℃冰箱過夜。PBS沖洗5 min×3，擦干組織周圍水分，加對應的二抗，室溫孵育2 h；三蒸水洗5 min×3次，擦凈切片周圍水分后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min、蘇木素復染、脫水、透明、封片。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠逃避潛伏期時間比較 與Sham組比較，Sevo組幼鼠暴露于5%七氟醚4 h后，幼鼠逃避潛伏期時間較Sham組明顯延長(P＜0.05)；與C組比較，Sham組幼鼠逃避潛伏期時間差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組幼鼠逃避潛伏期時間比較(±s，s，n=18)

表1 各組幼鼠逃避潛伏期時間比較(±s，s，n=18)

注：與Sham組比較，aP＜0.05。

組別C組Sevo組Sham組6周70.41±12.7 96.71±11.3a73.87±17.4 1周103.15±16.7 110.75±18.4a100.97±17.4 3周90.78±15.3 100.74±16.6a89.79±21.3

2.2 各組海馬CA1區(qū)pERK1/2表達OD的比較 Sevo組幼鼠暴露于5%七氟醚4 h后，第1周海馬CA1區(qū)pERK1/2蛋白表達開始降低，第6周降至最低，但組內(nèi)各時間點表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sham組組內(nèi)各時間點pERK1/2蛋白表達沒有明顯變化。Sevo組各時間點CA1區(qū)pERK1/2的表達水平均明顯低于Sham組(P＜0.05)。與C組比較，Sham組海馬CA1區(qū)pERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組海馬CA1區(qū)pERK1/2表達OD的比較(±s，n=18)

表2 各組海馬CA1區(qū)pERK1/2表達OD的比較(±s，n=18)

注：與Sham組比較，aP＜0.05。

C組Sevo組Sham組0.109±0.036 0.101±0.044a0.107±0.054 0.110±0.043 0.095±0.036a0.111±0.023 0.108±0.042 0.081±0.027a0.109±0.012

3 討論

七氟醚作為一種新型的吸入麻醉藥，對于發(fā)育中的大腦，是否能夠引起海馬神經(jīng)元的凋亡，對pERK1/2是否有抑制作用，國內(nèi)外尚無文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚可以明顯抑制海馬pERK1/2的表達，并對幼鼠獲取空間學習記憶能力產(chǎn)生一定的影響。

研究發(fā)現(xiàn)pERK1/2是腦發(fā)育過程中的重要蛋白質(zhì)分子，氯胺酮和異丙酚會降ERK1/2和Akt的磷酸化水平，導致凋亡，影響神經(jīng)元生長與發(fā)育。鋰能恢復ERK1/2和Akt的磷酸化水平，可以阻止氯胺酮和異丙酚引起的凋亡[1]。NMDA受體的激活，無論是用NMDA還是直接激活神經(jīng)元，都會激活不同的神經(jīng)傳導通路，有利于神經(jīng)元的存活；相關(guān)的機制包括鈣調(diào)蛋白激酶[2]、Akt[3]和ERK1/2[4]的激活，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[5]的釋放以及對葡萄糖合成激酶3β的抑制作用[6]。氯胺酮對pERK1/2和pAkt抑制作用是通過NMDA受體的，異丙酚也可以通過NMDA受體而抑制神經(jīng)元的激活。鋰能夠恢復pERK1/2的磷酸化水平，并達到抑制凋亡的目的。此外，鋰抑制凋亡對于正常的腦的發(fā)育也有重要作用。在腦發(fā)育期間，腦細胞的產(chǎn)生往往超過了正常需要；成人腦細胞的最終數(shù)量往往是特定神經(jīng)元的存活和過多神經(jīng)元的凋亡[7]。pERK1/2及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路對于對于發(fā)育中的大腦獲取空間學習記憶能力能有著重要的作用，因此本研究選擇pERK1/2作為研究目標。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚與先前研究的很多麻醉藥一樣，對于幼鼠海馬中pERK1/2的表達產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響其學習記憶能力。

本研究的發(fā)現(xiàn)提示，七氟醚對幼鼠學習記憶能力會產(chǎn)生的一定程度的影響，其影響與抑制海馬pERK1/2的表達有關(guān)。

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Effects of Sevoflurane on spatial learning and memory ability and the expression of pERK1/2 in hippocampal in neonatal SD rats.

LIU Yan-jun,YU Xiang-di,TANG He-qing,YUAN Hua-ping,CHEN Chun.
The First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Yichang Central People's Hospital,Yichang 443003,Hubei, CHINA

ObjectiveTo investigate effects of sevoflurane on spatial learning and memory ability and the expression of pERK1/2 in hippocampal in young SD rats.MethodsFifty-four young SD rats were randomly divided into three groups:Control group(C group),Sevoflurane group(Sevo group)and Sham operation group(Sham group), each with 18 rats.The rats in Sevo group were exposed in 5%sevoflurane for 4 hours,and the rats in S group were exposed in oxygen for 4 hours.Rats in three groups were taken to carry out the ethology observation for 7 days with Morris water maze 24 hours in 8:00～11:00 after 1 week,3 weeks and 6 weeks of sevoflurane exposing,and the expression of pERK1/2 was determined by immunochemistry.ResultsCompared with Sham group,the escape latency was significantly longer in Sevo group,and the expression of pERK1/2 was significantly inhibited in Sevo group(P＜0.01). There was no statistically significant difference between C group and Sham group in the escape latency and the expression of pERK1/2.ConclusionEffect of sevoflurane on spatial learning and memory ability of young SD rats is related to inhibition of pERK1/2 expression.

Sevoflurane;Hippocampus;pERK1/2;Spatial learning;Memory ability

R-332

A

1003—6350（2015）02—0161—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.02.0057

2014-07-28)