環杷明對馬兜鈴酸誘導的腎上皮細胞表型轉化及Hedgehog通路的影響*

洪煒龍， 陸 紅， 吳存造， 林成成， 梁 勇， 王斯璐， 陳必成， 白永恒△

(溫州醫科大學附屬第一醫院 1外科實驗室， 2醫學檢驗中心， 3移植科，浙江 溫州 325000)

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環杷明對馬兜鈴酸誘導的腎上皮細胞表型轉化及Hedgehog通路的影響*

洪煒龍1， 陸 紅2， 吳存造3， 林成成1， 梁 勇1， 王斯璐1， 陳必成1， 白永恒1△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1外科實驗室，2醫學檢驗中心，3移植科，浙江 溫州 325000)

目的： 探討環杷明干預Hedgehog(HH)信號對馬兜鈴酸(AA)致腎小管上皮細胞表型轉化和基質累積的影響。方法: 根據干預措施將體外培養的大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E分為溶劑對照組、AA損傷組(分別用終濃度為1、5和10 mg/L的AA處理細胞)和環杷明干預組(10 mg/L AA基礎上加入1、5和10 μmol/L環杷明)。細胞培養24 h后，用real-time PCR檢測HH信號關鍵分子Ptch1和Smo、表型轉化相關分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基質成分I型和III型膠原mRNA的表達；ELISA法檢測Shh和TGF-β1的含量；細胞免疫熒光染色檢測Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型膠原蛋白表達。結果: AA不僅增加了TGF-β1、α-SMA和III型膠原的表達，降低了E-cadherin和ZO-1的表達，而且誘導了Shh和Smo mRNA表達的升高和Ptch1 mRNA表達的下降，提示AA促進小管上皮細胞表型轉化和膠原累積，同時也激活了HH信號通路。環杷明干預AA作用后，Smo mRNA或蛋白表達下調，Ptch1 mRNA表達升高，這說明環杷明抑制了AA誘導的HH信號通路的活化。此外，環杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型膠原的表達，提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表達，這提示環杷明抑制了AA所致的上皮細胞的表型轉化和基質累積。結論: 環杷明可抑制AA所致的腎小管上皮細胞表型轉化和基質累積，可能是通過靶向抑制HH信號的活化來實現的。

環杷明； 馬兜鈴酸； 表型轉化； 基質累積； Hedgehog信號

前期研究顯示，馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)可誘導腎小管上皮細胞表達和釋放TGF-β1，促進上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，最終導致基質成分I和III型膠原的過度累積[1]。在此過程中，損傷的上皮細胞反饋性誘導與增殖相關信號的活化，引起細胞異常增殖可能是EMT和基質累積的關鍵因素。我們前期實驗也證實了AA所致EMT及基質累積過程中Hedgehog(HH)信號被激活[2]。然而，HH信號活化是否為AA所致的腎間質纖維化所必須，且AA損傷腎小管過程中，干預HH信號能否降低基質累積等均尚未明確。本研究擬通過環杷明(cyclopamine，Cyp)特異性阻斷HH信號活化，從體外實驗角度觀察其對AA所致的EMT和基質累積的影響。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑和儀器

大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

馬兜鈴酸(Sigma)；Cyp (Merck)；DMEM細胞培養液(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶和TRIzol提取液(Gibco)；兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) 單克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗鼠上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Abcam)；Shh和TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(上海西唐生物)；real-time PCR試劑(Promega)。

MyCycler梯度PCR儀(Bio-Rad)；7500定量PCR儀(Applied Biosystems)；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀(Thermo Scientific)；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 大鼠腎小管上皮細胞的培養和實驗分組 NRK-52E細胞用5%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2的培養箱培養。實驗前，調整細胞至適當密度并鋪板于6孔板中，當細胞融合度約為70%時，開始正式實驗。實驗設立溶劑對照組：不加入AA和Cyp；AA損傷組：細胞培養基中加入10 mg/L AA；Cyp干預組：在10 mg/L AA的基礎上，分別加入1、5和10 μmol/L的 Cyp。各組細胞培養24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。

2.2 Real-time PCR檢測mRNA的表達 采用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA，測定260/280 nm吸光度值以確定純度和濃度。根據試劑說明書將RNA逆轉錄成cDNA。針對骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)、Ptch1、Smo、α-SMA、E-cadherin、ZO-1、I型膠原(collagen I)和III型膠原的mRNA設計特異性引物，以GAPDH作為內參照，采用real-time PCR相對定量法進行檢測。引物由上海捷瑞公司合成，序列如表1所示。取逆轉錄產物1 μL進行定量PCR，PCR擴增體系：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、上下游引物各1 μL，終濃度為200 nmol/L、1 μL cDNA、2 μL反應緩沖液。擴增程序為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s， 60 ℃ 35 s，40個循環。通過熔解曲線評價PCR結果可靠性，采用2-ΔΔCt計算相對mRNA表達量。

2.3 ELISA檢測Shh和TGF-β1的含量 細胞培養24 h，取培養上清液。采用雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1和Shh的含量，即預先分別將抗大鼠TGF-β1和Shh單抗包被于酶標板，并特異性地與標準品和樣品中的TGF-β1和Shh結合，分別加入生物素化的抗大鼠TGF-β1和Shh，形成免疫復合物連接在酶標板上，并利用辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素與生物素結合，與加入的底物工作液反應顯藍色，最后加入硫酸終止顯色反應，測量在450 nm處的吸光度值(A)，通過繪制標準曲線求出Shh與TGF-β1濃度。

2.4 細胞免疫熒光檢測Ⅲ型膠原、α-SMA和E-cadherin蛋白的表達 取對數生長期NRK-52E細胞，分為溶劑對照組、AA損傷組和AA基礎上分別加入1、5和10 μmol/L Cyp干預組并進行爬片培養24 h，棄去培養基，用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100破膜。0.5%正常山羊血清封閉。各爬片滴加針對α-SMA、E-cadherin和III型膠原的 I 抗工作液，4℃孵育過夜。用Dylight 488(綠色)或594(紅色)標記的 II 抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于蓋玻片上，室溫染色5 min。細胞胞質綠色或紅色和胞核藍色為陽性著色。每組取10張片，每張取10個高倍視野(×400)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光累積光密度(IA)值。

表1 擴增HH信號通路、EMT和細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)相關基因mRNA的特異性引物

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析，計量資料結果以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組樣本比較采用t檢驗和精確概率法，多組樣本比較采用單因素方差分析，兩組樣本關聯性比較采用相關分析。以P<0. 05為差異有統計學意義。

結 果

1 Cyp對AA誘導腎小管上皮細胞基質累積的影響

細胞免疫熒光染色結果顯示，10 mg/L的AA作用NRK-52E細胞后，可顯著上調III型膠原蛋白的表達。用Cyp干預后，III型膠原表達水平顯著下降，并呈現一定的濃度依賴關系，見圖1。Real-time PCR結果顯示，AA不僅增加了collagen Ⅲ mRNA的表達，同樣也提高了collagen Ⅰ mRNA的表達，見圖2。Cyp干預后，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA的表達水平均顯著下調。這些結果提示，Cyp能抑制AA所致的基質累積效應。

2 Cyp對AA誘導腎小管上皮細胞EMT的影響

Real-time PCR結果顯示，AA下調了E-cadherin和ZO-1 mRNA的表達水平，上調了α-SMA mRNA的表達水平，見圖2。細胞免疫熒光染色顯示，AA也下調了E-cadherin蛋白的表達，升高了α-SMA的表達，見圖3。應用Cyp干預后，E-cadherin和ZO-1表達上調，而α-SMA的表達下降。此外，Cyp上調了表型轉化抑制因子BMP-7 mRNA的表達。這些結果顯示，Cyp可抑制AA所致的EMT進程。

Figure 1.The expression of type III collagen in the NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs A group ; #P<0.05, ##P<0.01 vs C group.

3 Cyp對AA誘導的腎小管上皮細胞表達TGF-β1的影響

本實驗中，Cyp的干預可有效降低NRK-52E細胞分泌TGF-β1量，并且其抑制作用呈現Cyp濃度依賴性，見圖4。

4 Cyp對AA誘導的腎小管上皮細胞HH信號表達的影響

Real-time PCR結果顯示，Cyp作用NRK-52E細胞24 h后，隨著Cyp濃度增加，Ptch1 mRNA表達量顯著上調，Smo 的mRNA表達顯著下調，提示HH信號通路被抑制，見圖5。細胞免疫熒光染色結果也顯示Cyp逆轉了AA所致的Smo高表達和Ptch1低表達,見圖6。然而，ELISA結果發現，隨著Cyp濃度增加，Shh分泌表達量呈現上升趨勢(圖7)，我們推測這可能與HH信號被阻斷后導致信號起始因子Shh的蓄積作用有關。

Figure 2.The mRNA expression of ECM and EMT related molecules in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ## P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 3.The expression of E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs A group; #P<0.05 vs C group.

Figure 4.The contents of TGF-β1 in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L)determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

討 論

HH信號通路主要由配體 sonic hedgehog(Shh)、膜受體Patched(Ptch)、信號開關蛋白Smoothened(Smo)及下游的轉錄因子Gli組成[3]。正常表達的HH信號在器官發育和器官修復再生過程中起著重要作用[4]，但持續異常激活的HH信號可導致胰腺癌等多種腫瘤的發生[5]。

近來有研究報道，HH信號活化也參與了多種組織的纖維化[6-7]。在梗阻性膽管疾病中，HH可被活化，進而促進膽管上皮細胞EMT，最終導致膽管纖維化[6]。我們前期研究也顯示，輸尿管梗阻誘導大鼠腎間質纖維化過程中，可激活HH信號[7]?；罨腍H信號可提高TGF-β1的表達，促進小管上皮細胞向間質細胞轉化，最終導致基質成分在腎間質的過度累積。因此，可以從HH信號轉導途徑上入手，查找信號調控的相關藥物，可發揮一定的抗纖維化作用。

最近研究顯示，環耙明可調控HH信號的轉導，進而抑制肝纖維化[7]。Cyp是一種從藜蘆屬植物內分離得到的異甾體類生物堿。Cyp可特異性改變Smo空間構象，抑制其活性，從而抑制HH信號通路[8-9]。此外，Cyp與Smo結合能夠使細胞的分裂停止于G0/G1期，誘導細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。然而，Cyp調控HH信號活化通過何種機制影響AA所致的纖維化進程尚不清楚。本研究結果顯示，AA可上調TGF-β1、Smo、α-SMA、I型和III型膠原的表達，下調BMP-7、E-cadherin、ZO-1和Patch1表達。TGF-β1是一種重要的促纖維化因子，其表達升高可誘導多種上皮細胞發生表型轉化和基質累積，E-cadherin和ZO-1均為上皮細胞標志物，而α-SMA為肌成纖維細胞標志物，E-cadherin和ZO-1表達的降低和α-SMA表達的增加提示AA誘導了腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞樣細胞轉化。Patch1表達的下調和Smo表達的上調則提示HH信號被活化。我們推測，在AA損傷微環境中，損傷嚴重的上皮細胞可能發生凋亡、壞死、崩解并釋放大量炎癥因子、趨化因子等細胞因子，誘導周圍未受損或受損程度較輕的上皮細胞異常增殖。同時，與增殖相關的HH信號被活化?；罨腍H信號推動小管上皮細胞轉化為肌成纖維細胞，而后者能分泌膠原成分在局部累積導致纖維化樣改變。應用Cyp可抑制HH信號通路，下調肌成纖維細胞和纖維化相關分子的釋放和表達，進而抑制膠原累積降低纖維化樣改變。此外，研究也發現，HH通路被抑制情況下，Shh分泌表達量呈現上升趨勢，推測可能與HH信號被阻斷后導致信號起始因子Shh的蓄積作用有關。

Figure 5.The mRNA expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AA 10 group.

Figure 6.The expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment (×400). Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 7.Shh contents in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

綜上所述，我們初步從體外實驗角度揭示Cyp可通過靶向阻斷HH信號，下調了AA誘導的TGF-β1的表達和釋放，抑制EMT和膠原累積，最終緩解纖維化樣改變。然而，Cyp干預HH信號進而發揮抗纖維化作用尚需未來的體內實驗予以證實。從信號轉導的調控途徑上查找有效的治療藥物，在一定程度上可為腎間質纖維化的治療提供新的思路。

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Effect of cyclopamine on aristolochic acid-induced phenotypic transformation and Hedgehog pathway in renal epithelial cells

HONG Wei-long1, LU Hong2, WU Cun-zao3, LIN Cheng-cheng1, LIANG Yong1, WANG Si-lu1, CHEN Bi-cheng1, BAI Yong-heng1

(1SurgeryLaboratory,2DepartmentofLaboratoryMedicine,3DepartmentofTransplantation,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:greatsailor@163.com)

AIM: To investigate the effect of cyclopamine on Hedgehog (HH) signaling, phenotypic transformation and matrix accumulation induced by aristolochic acid (AA) in renal tubular epithelial cell NRK-52E. METHODS: NRK-52E cells were randomly divided into control group (treated with solvent only), AA group (treated with AA at concentrations of 1, 5, 10 mg/L) and cyclopamine group (treated with AA at concentration of 10 mg/L plus cyclopamine at concentrations of 1, 5, 10 μmol/L). After cultured for 24 h, the mRNA expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin, ZO-1, BMP-7, type I collagen and type III collagen was quantified by real-time PCR. The protein levels of Shh and TGF-β1 were detected by ELISA. Immunofluorescence staining was used to evaluate the expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin and type III collagen in the NRK-52E cells. RESULTS: AA increased the expression of TGF-β1, α-SMA and type III collagen, decreased the expression of E-cadherin and ZO-1 protein, and down-regulated the expression of Ptch1， Shh and Smo mRNA in the NRK-52E cells, indicating that AA activated HH signaling, and phenotypic transformation and matrix accumulation occurred in AA-treated NRK-52E cells. Treatment with cyclopamine inhibited HH signaling by decreasing Smo expression and increasing Ptch1 expression. Moreover, cyclopamine also down-regulated the expression of TGF-β1, α-SMA, type I collagen and III collagen, and up-regulated the expression of BMP-7, ZO-1 and E-cadherin. CONCLUSION: AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells, which can be inhibited by cyclopamine treatment. The possible mechanism is that cyclopamine suppresses the activation of HH signaling, resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

Cyclopamine; Aristolochic acid; Phenotype transformation; Matrix accumulation; Hedgehog signaling

1000- 4718(2015)01- 0069- 07

2014- 03- 27

2014- 12- 03

浙江省自然科學基金資助項目(No. LQ12H05001; No. LY12H05004)；溫州市科技局項目(No. Y20110028; No. Y20130149)

△通訊作者 Tel： 0577-55579220； E-mail：greatsailor@163.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.014