扶腎降濁方含藥血清對腎小管間質損害大鼠成纖維細胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響*

李春雨， 魏曉露， 蘇瑋蓮， 李國霞

(天津醫科大學國際醫學院，天津 300070)

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扶腎降濁方含藥血清對腎小管間質損害大鼠成纖維細胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響*

李春雨， 魏曉露， 蘇瑋蓮， 李國霞△

(天津醫科大學國際醫學院，天津 300070)

目的： 探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)大鼠腎小管間質損害的療效及機制。方法: 采用扶腎降濁方水溶液灌胃Wistar大鼠常規制備含藥血清，在MsPGN動物模型的基礎上，延長造模時間至20周，使其自然發展為腎小管間質損害模型，體外培養造模12、16和20周末大鼠間質成纖維細胞，采用real-time PCR和Western blotting法檢測扶腎降濁方含藥血清對病理狀態間質成纖維細胞中抗纖維化因子肝細胞生長因子(HGF)、骨形態發生蛋白-7(BMP-7)mRNA及蛋白表達的影響。結果: 病理狀態間質成纖維細胞中抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達下調，扶腎降濁方含藥血清隨著給藥周期的延長可部分逆轉間質損害造成的上述mRNA和蛋白表達異常。結論: 扶腎降濁方含藥血清對MsPGN大鼠間質成纖維細胞的保護作用可能與調節抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達有關。

扶腎降濁方； 腎間質成纖維細胞； 血清藥理學方法； 肝細胞生長因子； 骨形態發生蛋白-7

腎小管間質損害是腎小球腎炎由炎癥啟動進展至腎小球硬化的中間環節，腎小球腎炎進展至腎小球硬化，大多已不可逆轉，而對其中間環節即腎小管間質損害進行早期有效干預則可大大延緩腎小球腎炎進展，對防治慢性腎臟疾病具有重要意義[1-2]。扶腎降濁方在臨床廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，多年的臨床實踐取得了總有效率82.5%的療效[3]。動物實驗表明，扶腎降濁方(Fushen Jiangzhuo formula，FSJZ)能改善慢性腎功能衰竭大鼠的常規生化指標，延緩腎衰的病理進程[4]。但對腎小管間質損害的保護作用機制尚不十分清楚。本文在前期研究的基礎上采用血清藥理學的研究方法，基于抗纖維化因子肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、骨形態發生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)，從體外細胞實驗角度，探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)腎小管間質損害的保護作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑、儀器和動物

扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹參30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，實驗所用中藥制劑為天津中醫藥大學中藥學院按既定工藝制備的配方顆粒，每克含生藥4.06 g，批號為20120810；葡萄球菌腸毒素B由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Sigma產品；牛血清白蛋白(BSA)為AMRESCO產品；Trizol Reagent、反轉錄試劑盒及real-time PCR試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blotting檢測試劑盒和ECL化學發光底物試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。

DMI4000B倒置熒光顯微鏡(Leica)；電泳儀購自大連競邁生物科技有限公司；DH-2000凝膠圖像采集分析系統購自Heraeus；ABI 7500型實時熒光定量基因擴增儀為美國應用生物系統公司產品。

雄性Wistar大鼠12只，體重(150 ± 10)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所提供，合格證號為SCXK(軍)2009-003。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 Wistar大鼠6只隨機分為扶腎降濁方組(3只)和空白對照組(3只)。扶腎降濁方組以每千克51.5 g生藥劑量(成人劑量15倍)灌胃給藥，每日2次(空白對照組給予等體積生理鹽水)連續3 d，于末次給藥后1 h腹主動脈取血，靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活血清，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存備用。

2.2 病理狀態間質成纖維細胞的培養 參照文獻復制MsPGN大鼠動物模型[5-6]。6只Wistar大鼠隨機分為模型組(3只)和空白對照組(3只)，自實驗第1天起，模型組大鼠以20 mg BSA配成水溶液，隔日灌胃1次，空白對照組給予等體積生理鹽水，隔日灌胃1次，共12～20周。實驗的第1天模型組分點注射完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)、第8 天注射不完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)，實驗的第8天和15天分別經尾靜脈注射金黃色葡萄球菌腸毒素B水溶液(0.4 mg/kg)各1次。空白對照組注射等體積生理鹽水。經Masson染色研究證實本實驗MsPGN大鼠動物模型復制成功。取第12、16和20周的模型大鼠間質成纖維細胞進行培養，同時培養正常大鼠間質成纖維細胞作為空白對照。無菌條件下，將富含小管間質的腎組織剪碎成1 mm×1 mm×1mm小塊，經PBS洗滌，胰蛋白酶消化，調整細胞密度至1.0×109/L后接種于含10%胎牛血清DMEM培養皿中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，將細胞以1.2×109/L接種于6孔培養板，分為空白對照組(正常間質成纖維細胞)、模型組、含藥血清低、中、高劑量組(分別為5%、10%、20%FSJZ方含藥血清)，每組設3個復孔，各組細胞繼續培養12 h后，加入含藥血清(空白對照、模型組加入20%體積的對照血清)作用48 h后，進行相關指標檢測。

2.3 Real-time -PCR檢測mRNA水平 Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書進行cDNA第1鏈的合成。以反轉錄產物為模板，引物序列見表1，進行real-time PCR反應。反應體系為20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，逆轉錄產物1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應條件為95 ℃15 min；95 ℃10 s、50～60 ℃30 s循環40次。反應結束后自動生成熔解曲線，結果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量分析[7-9]。

表1 基因引物序列

2.4 Western blotting法檢測蛋白水平 蛋白變性后在10% SDS-PAGE中分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入Ⅰ抗4 ℃搖床振蕩孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室溫搖床振蕩孵育2 h，ECL化學發光法顯影，Gel-Pro 3.2軟件對結果進行灰度分析。

3 統計學處理

用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞HGF、BMP-7 mRNA表達的影響

MsPGN大鼠腎小管間質損害后體外培養間質成纖維細胞，模型組與對照組比較，HGF和BMP-7的 mRNA表達下調(P<0.05)。隨著造模時間的延長，10%含藥血清組在第20周，20%含藥血清組在第12、16和20周成纖維細胞HGF mRNA的表達明顯上調(P<0.05)；5%含藥血清組在第20周，10%、20%含藥血清組在第12、16和20周成纖維細胞BMP-7 mRNA表達明顯上調(P<0.05)。見表2、3。

表2 扶腎降濁方對腎間質成纖維細胞HGF mRNA表達的影響

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

表3 扶腎降濁方對腎間質成纖維細胞BMP-7 mRNA表達的影響

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞HGF、BMP-7蛋白表達的影響

MsPGN大鼠腎小管間質損害后體外培養間質成纖維細胞，模型組與對照組比較，HGF、BMP-7蛋白表達明顯下調(P<0.05)。5%、10%、20%扶腎降濁方含藥血清組在第12、16、20周成纖維細胞HGF、BMP-7的蛋白表達明顯上調(P<0.05)。見圖1～3。

討 論

HGF和BMP-7是重要的腎營養因子，負性調節腎纖維化[10]。HGF是一種對多種器官具有多效性的多肽細胞因子，在動物模型中能明顯抑制患病腎臟系膜細胞及成纖維細胞的活化。其拮抗TGF-β1介導成纖維細胞激活，阻斷小管細胞轉化而阻止腎臟纖維化作用，因此，HGF水平下降會加重腎纖維化程度。BMP-7是另一種重要的腎營養因子，廣泛表達于各種腎臟細胞且對腎臟的發育起著決定性作用[11]。在腎臟發育過程中，BMP-7缺乏導致腎間充質細胞死亡，BMP-7缺乏的小鼠在圍產期死于尿毒癥。BMP-7與受體結合后，可活化Smad 6，使得Smad 6表達增加，Smad 6是TGF-β信號通路的負反饋調節分子，能抑制Smad 2和Smad 3的磷酸化而抑制TGF-β導致纖維化和致腎小管細胞轉分化效應，從而達到抗纖維化的作用[12]。

Figure 1.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 2.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 3.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal in terstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

前期研究發現，扶腎降濁方干預腎小管間質損害造成的腎組織TGF-β1/Smads/ILK信號轉導通路基因和蛋白表達異常，負性調節腎小管EMT，減少炎細胞的浸潤與減輕腎小管間質和腎小球損傷，延緩腎小管間質損害病程的進展[13]。那么，扶腎降濁方在延緩腎小管間質損害病理進程和抗腎纖維化方面是否還有更深、更多的影響和機制？本研究從腎小管間質纖維化的第2階段(抗纖維化的因子HGF、BMP-7釋放，參與腎臟的自身防御，促進炎癥消散和組織修復)著手，觀察扶腎降濁方含藥血清對腎小管間質損害大鼠間質成纖維細胞抗纖維化因子HGF和BMP-7的影響，探討扶腎降濁方含藥血清對MsPGN腎小管間質損害大鼠腎間質成纖維細胞的保護作用及機制。

本研究在MsPGN動物模型的基礎上，延長造模時間至20周，使其自然發展為腎小管間質損害模型，第12、16和20周的模型大鼠腎臟經病理組織學觀察，證實MsPGN動物模型復制成功。光鏡檢查第12周模型大鼠腎小管上皮細胞出現腫脹、顆粒變性、壞死，個別小管完全萎縮，Masson染色顯示有間質纖維化伴炎細胞浸潤。第16周、20周模型大鼠小管變性、壞死程度進一步加重，Masson染色顯示腎小球和腎間質有大量纖維組織增生及大量炎細胞浸潤，且病變隨著時間延長逐步加重，此部分研究內容另行發表。

本實驗研究發現，MsPGN大鼠發展為腎小管間質損害后，體外培養病理狀態間質成纖維細胞，抗纖維化因子HGF、BMP-7mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，隨著造模時間的延長，扶腎降濁方含藥血清能部分逆轉腎小管損害造成的上述mRNA和蛋白表達的異常，提示扶腎降濁方含藥血清可通過升高抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白的表達，可能是其發揮保護腎小管間質作用的機制，本研究為中醫藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路。

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促纖維化蛋白WNT5A在膿毒癥誘導的急性肺損傷的早期被激活

急性呼吸窘迫綜合征中肺損傷和纖維化的機制鮮為人知。WNT/β-連環蛋白信號通路的功能在肺修復和纖維化中日益受到重視，為了證實這條通路在膿毒癥之后早期在肺組織中被激活。一組西班牙科學家在體外肺細胞損傷模型中將人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)和人胚肺成纖維細胞(MRC-5)暴露在內毒素中18 h，用盲腸末端結扎穿孔術誘發動物膿毒性急性呼吸窘迫綜合征，并從因患敗血癥性急性呼吸窘迫綜合征而死亡的病人身上提取死亡24 h的肺組織，通過免疫印跡和免疫組織化學的方法檢測涉及 Wnt 通路的WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-連環蛋白、基質金屬蛋白酶7(MMP7)、細胞周期蛋白D1和血管內皮生長因子。他們發現這些蛋白質就是WNT/β-連環蛋白信號通路的主要靶點。WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-連環蛋白、總β-連環蛋白、MMP7、細胞周期蛋白D1蛋白和血管內皮生長因子在經內毒素刺激的BEAS-2B和MRC-5細胞中均增加。從膿毒血癥動物和膿毒血癥患者的肺組織中可以發現急性肺部炎癥，膠原蛋白沉積，WNT5A和MMP7蛋白水平明顯增加。因此，在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征中WNT/β-連環蛋白信號通路會在早期被激活，并且能夠在肺的修復和纖維化中起重要的作用。對這條通路的調整可能是治療膿毒血癥和急性呼吸窘迫綜合征的潛在靶點。

Crit Care, 2014, 18(5):568(唐翔詡)

Effect of drug-containing serum of Fushen Jiangzhuo formula on anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 in rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion

LI Chun-yu, WEI Xiao-lu, SU Wei-lian, LI Guo-xia

(InternationalMedicalSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China.E-mail:liguoxia96@163.com)

AIM: To study the protective effects and mechanism of Fushen Jiangzhuo formula (FSJZ) on the rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion. METHODS: The serum containing FSJZ and blank control serum were prepared. The rat model of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN) was established and extended the time of modeling to 20th weeks for developing tubulointerstitial lesion naturally. The rat renal interstitial fibroblasts at the end of 12, 16, 20 week of modeling were isolated and cultured. The effects of FSJZ on the expression of hepatocyte growth factor (HGF) and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) at mRNA and protein levels in the pathological renal interstitial fibroblasts were determined. RESULTS: The anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 were changed in pathological renal interstitial fibroblasts. Renal tubulointerstitial lesion significantly down-regulated the expression of HGF and BMP-7, while the drug containing serum of FSJZ significantly up-regulated the expression of HGF and BMP-7. CONCLUSION: Drug containing serum of FSJZ has protective effect on pathological renal interstitial fibroblasts by regulating the mRNA and protein expression of HGF and BMP-7.

Fushen Jiangzhuo formula; Renal interstitial fibroblasts; Serologic pharmacological test; Hepatocyte growth factor; Bone morphogenetic protein-7

1000- 4718(2015)01- 0076- 05

2014- 08- 08

2014- 09- 30

天津市自然科學基金資助項目(No. 11JCYBJC12800)

△通訊作者 Tel: 022-83336911； E-mail: liguoxia96@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.015