烤煙品種K326及其耐低溫抗早花變異系基因表達譜分析

楊　靜，陳　杰，陳建軍，鄧世媛，邱妙文，趙偉才，王　維*

（1.黔東南州煙草公司鎮遠縣分公司，貴州鎮遠 557700；2.華南農業大學農學院，廣州 510642；3.黔東南州煙草公司，貴州凱里 556000；4.廣東省煙草南雄科學研究所，廣東南雄 512400）

烤煙品種K326及其耐低溫抗早花變異系基因表達譜分析

楊靜1，2，陳杰3，陳建軍2，鄧世媛2，邱妙文4，趙偉才4，王維2*

（1.黔東南州煙草公司鎮遠縣分公司，貴州鎮遠 557700；2.華南農業大學農學院，廣州 510642；3.黔東南州煙草公司，貴州凱里 556000；4.廣東省煙草南雄科學研究所，廣東南雄 512400）

摘要：為了解烤煙早花與抗早花的形成及調控機制，本研究利用安捷倫煙草全基因組芯片分析了烤煙品種K326及其抗早花品系華煙06莖尖端花芽分化過程中基因的表達。結果表明，K326與華煙06距離各自花芽分化相同時間的莖尖端未花芽分化時的差異探針數最多，有5295個；K326分化當天各品種（品系）之間相比較差異探針數量最少，有2116個。與分子功能相關的差異基因主要與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能有關；與細胞組成相關的差異基因主要是與細胞、細胞組分、細胞器相關的基因；與生物學過程相關的差異基因種類最多最復雜，涉及到植株抗逆性、生長、發育等方面，這對進一步研究與從中搜尋與煙草開花相關的基因奠定了基礎。

關鍵詞：烤煙；早花；抗早花；基因芯片；表達譜

煙草早花指植株未能達到正常生長應具有的高度和葉數就現蕾開花。國內外烤煙均存在煙草早花問題［1-2］，嚴重影響著煙葉的生產。近百年來，人們在開花生理生化方面進行了大量的探索［3］，直到1990年，Yanofsky等［4］成功地分離了花器官發育控制基因AGAMOUS，植物發育生物學的機理研究由以生理生化為主轉變到以分子生物學及生理遺傳學為主。擬南芥開花基因的研究開啟了植物開花基因研究的大門，水稻、谷物、果樹中與開花相關的基因的研究也已取得了很大的進展，與開花相關的

（http：//www.shanghaibiotech.com），利用在線SAS系統進行數據分析。通過GO（Gene Ontology）分析對兩倍以上的差異表達基因進行功能注釋和富集分析。

1.5熒光定量PCR驗證

利用煙草Actin基因（AB158612）為內參，從基因芯片分析結果中隨機挑選出5個與開花相關的基因，進行實時熒光定量PCR，熒光定量PCR所用材料與基因芯片的材料及處理方式完全一樣。3次重復，反應條件為95℃，10min；接著進行40個循環：95℃，15秒；60℃，30 s。算法為log2 2-ΔΔ Ct。

表1　差異探針分析Table1　Analysis of differential probes

圖2　與分子功能及細胞組成相關的顯著富集基因Fig.2　Molecular function related and cellular component related significantly enriched genes

2　 結果

2.1 芯片數據驗證

試驗中K326于4月11日現蕾，華煙06于4月24日現蕾，二者現蕾時間相差13 d。為了驗證芯片分析結果，隨機挑選了5個與開花有關并具有代表性的差異基因（CCR2，ELF4，AGL20，CBF1，COL9）進行熒光定量PCR驗證，結果表示芯片表達譜信息具有較高的可靠性。

2.2芯片掃描結果中差異探針數的基本特征

按照兩倍以上（FC＞2或FC＜0.5）差異為有效差異的標準篩選差異探針，將基因表達情況分別進行縱向比較和橫向比較。縱向比較為K326和華煙06各自花芽分化過程中莖尖端基因表達情況的比較；橫向比較包括：K326和華煙06距離各自花芽分化19 d時莖尖端基因表達情況的比較；K326花芽分化當天，K326與華煙06的比較；花芽分化時K326莖尖端基因表達情況與華煙06的比較（表1）。其中K326與華煙06距離各自花芽分化相同時間的莖尖端未花芽分化時的差異探針數最多，有5295個；K326分化當天各品種（品系）之間相比較差異探針數量最少，有2116個。

2.3縱向比較中差異基因的功能分類及富集分析

華煙06中與分子功能相關的差異表達基因可分為13類，而K326只有12類，其中少了蛋白標簽（protein tag）；華煙06中與細胞組分相關的差異基因有9類，K326有10類，多了與共質體（symplast）相關的基因（表2）。

K326花芽分化過程中，未分化與分化相比，分子功能中顯著富集的差異基因主要與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能有關，這與華煙06一致；K326花芽分化與分化后5 d相比，除了與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能有關的基因在莖尖端顯著富集之外，與酶調節活性、營養貯存活性有關的基因也顯著富集；與細胞組成相關的顯著富集的基因有胞外區、細胞、細胞器及細胞組分相關的基因等（圖2）。

K326和華煙06花芽分化過程中與生物學過程相關的基因分類共有24種，通過極顯著富集篩選出16種，其中包括發育過程、刺激應答、生殖過程等（表3）。

表2　差異表達基因的GO功能分類Table2　GO functional category of differential expressed genes

表3　與生物學過程相關的極顯著富集基因Table3　Biological process related highly significantly enriched genes

2.4橫向比較中差異基因的功能分類與富集分析

K326和華煙06距離各自花芽分化天數相同、花芽未分化的莖尖端基因表達情況相比，與分子功能相關的顯著富集的基因主要與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能相關，K326分化當天與華煙06相比，與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能相關的差異基因顯著富集，K326、華煙06花芽分化時的差異表達基因中，與催化性能、轉運活性、結合性能、轉錄調節性能、分子轉導活性有關的基因顯著富集；K326和華煙06距離各自花芽分化相同天數的差異表達基因中，與細胞組成相關的顯著富集的基因主要與細胞、細胞器、細胞組分、胞外區組分、胞外區相關，K326分化當天，與胞外區、細胞、細胞組分相關的基因顯著富集（圖3）。

圖3　橫向比較中與分子功能及細胞組成相關的顯著富集基因Fig.3　Molecular function related and cellular component related significantly enriched genes by horizontal comparison

K326分化當天差異表達基因最少，其中對死亡、刺激反應、定位、生物調節及生物調節進程相關、生物進程正向調節相關的差異基因都有極顯著富集（圖4）。

3　 討論

試驗結果表明，在低溫誘導下，K326移栽后65 d即開始現蕾，而華煙06則表現出了明顯的抗早花特性，移栽后60 d才開始花芽分化。植物對環境刺激高度敏感，Lee等［12］的研究結果表明，即便是短時期的觸碰和黑暗處理也會導致植物基因芯片檢測結果存在較大差異。從本試驗的比較結果看，K326與華煙06花芽均未分化且距離各自花芽分化時間相同點相比的差異探針數最多，達到5295個，而K326分化當天，二者之間相比差異探針數量最少，差異探針數為2116個，這說明基因表達差異不僅與植株的生長發育時期及遺傳因素有關，更多的表達可能與氣溫及日照長短有關。

圖4　橫向比較中與生物學過程相關的極顯著富集基因Fig.4　Biological process related highly significantly enriched genes by horizontal comparison

各品種（品系）生長發育過程中，分子功能、細胞組成、生物學過程相關的差異基因數量雖有一定差異，但分布比例是一致的，這說明K326與華煙06生長發育過程中基因總體的調控機制是相似的，這說明調控不同烤煙品種（品系）生長的基本機理相近，是否具有耐低溫抗早花特性取決于少量特殊基因的表達。

為了進一步了解花芽分化過程中基因的表達變化及調控機制，有必要對差異基因進行顯著和極顯著富集分析，以確定差異表達基因行使的主要生物功能及其對植株花芽形成所具有的影響［13］。雖然K326花芽分化當天的差異基因數量最少，但通過顯著富集分析，與營養儲蓄相關的差異基因顯著富集，這可能與植株的生長發育狀態有密切關系。從與細胞組成相關的差異基因的顯著富集分析看，K326花芽分化與分化后5 d相比的差異基因的分類要多于其未分化與分化時相比的差異基因分類；而華煙06花芽未分化1與花芽未分化2相比，與細胞組成相關的差異基因種類要比未分化2與分化時相比的多，調控細胞生長的基因的表達有待進一步研究。

4　結論

本試驗通過比較分析，初步了解了K326及其抗早花品系花芽分化過程中基因的調控及表達機制。與分子功能相關的差異基因主要與催化性能、轉運性能、結合性能和轉錄調節性能有關；與細胞組成相關顯著富集的差異基因主要是與細胞、細胞組分、細胞器相關的基因；與生物學過程相關的差異基因種類最多最復雜，涉及到植株抗逆性、生長、發育等方面，這可為進一步研究并從中搜尋與煙草開花相關的基因提供參考依據。

參考文獻

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中圖分類號：S572.03

文章編號：1007-5119（2015）02-0093-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.017

基金項目：國家煙草專賣局重點科技項目“耐低溫抗早花烤煙新品種選育及遺傳生理機理研究”（110200902043）；廣東省煙草專賣局（公司）科技項目“耐低溫抗早花烤煙新品種選育”（200816）；國家自然科學基金項目“抗早花煙草成花生理信號物質運轉及其抵御低溫的生理機理研究”（31101108）

作者簡介：楊靜，女，碩士研究生，研究方向為煙草遺傳育種。E-mail：yangjinggzchina@163.com。*通信作者，E-mail：wangwei@scau.edu.cn

收稿日期：2014-07-08 修回日期：2015-03-09

Gene Expression Profile Analysis of Flue-cured Tobacco K326and thePremature Flowering Resistance Varieties

YANG Jing1，2， CHEN Jie3， CHEN Jianjun2， DENG Shiyuan2， QIU Miaowen4， ZHAO Weicai4， WANG Wei2*
（1.Zhenyuan County Tobacco Company of Guizhou Province， Zhenyuan， Guizhou 557700， China； 2.College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China；3. Qiandongnan Tobacco Company of Guizhou Province， Kaili，Guizhou 556000， China；4.Nanxiong Institute of Tobacco Science， Guangdong Provincial Tobacco Company， Nanxiong， Guangdong 512400，China）

Abstract：To study the regulation and formation mechanismof premature flowering and premature flowering resistance of flue-cured tobacco， we used the Agilent Tobacco Oligo Microarray to deduce the expression profiling of flue-cured tobacco K326 and its premature flowering resistance variety Huayan06 under the flower bud differentiation process. The result showed that the same days from their flower bud differentiation the number of differential probes were the maximum amount of the comparative item between K326 and Huayan06. The number of the probe was 5295. On the day of K326 flower bud differentiation， the number of differential probe was the minimum amount. The number of the probe was 2116. The molecular function mainly included catalytic activity，transporter activity， binding and transcription regulator activity. The cellular component mainly included cell， cell part and organelle. The biological process was the most complex， involved plant resistance， growth， development， etc. It would establish a basis for the further study and search for genes associated with tobacco flowering.

Keywords:flue-cured tobacco； premature flowering； premature flowering resistance； gene chip； expression profile