西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優良乳酸菌的篩選

楊曉丹，原現軍，郭剛,2，崔棹茗，李君風，白晰，巴桑，邵濤*

(1.南京農業大學,飼草調制加工與貯藏研究所,江蘇 南京 210095； 2.山西農業大學動物科學技術學院,山西 太谷030801；3.西藏日喀則地區草原工作站，西藏 日喀則 857000)

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西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優良乳酸菌的篩選

楊曉丹1，原現軍1，郭剛1,2，崔棹茗1，李君風1，白晰1，巴桑3，邵濤1*

(1.南京農業大學,飼草調制加工與貯藏研究所,江蘇 南京 210095； 2.山西農業大學動物科學技術學院,山西 太谷030801；3.西藏日喀則地區草原工作站，西藏 日喀則 857000)

本研究對西藏地區豆科牧草青貯飼料中的乳酸菌進行分離、鑒定，以期得到優良的乳酸菌菌株。以苜蓿和箭筈豌豆青貯飼料為試驗材料，共分離得到6株同型發酵乳酸菌，經傳統微生物培養和16S rRNA序列分析，3株(LCG9，CG35和AG11)為戊糖片球菌，2株(LCG3和LAG1)為植物乳桿菌，1株(LA3)為彎曲乳桿菌；除AG11和LAG1在5℃，LCG9和AG11在pH 3.0和8.0生長微弱外，其余乳酸菌菌株均在5～20℃，pH 3.0～8.0及3.0%和6.5% NaCl培養液中生長良好。從耐低溫特性、產酸能力和發酵速率3個指標考慮，植物乳桿菌LCG3最適宜用于西藏青貯飼料生產的乳酸菌菌種。

豆科牧草；青貯飼料；乳酸菌；分離；鑒定

西藏自治區是我國五大牧區之一，畜牧業是西藏農業經濟的主導產業。但是青藏高原平均海拔高達4000 m，自然氣候條件惡劣，寒冷季節長達7～9個月，導致牧草生長期短，季節性飼草不平衡，畜牧業生產陷入“夏肥、秋壯、冬瘦、春死”的惡性循環。為了滿足牧區反芻家畜冬春季節對飼草料的需求，將農區富余的牧草及農作物秸稈調制成優質青貯飼料是解決牧區畜牧業發展困境的有效途徑之一[1-3]。

青貯原料中乳酸菌的種類、數量及活性是影響青貯飼料發酵品質的重要因素，早期的研究[4]發現在西藏青貯飼料生產中，添加商品乳酸菌制劑未能有效地改善青貯飼料的發酵品質，可能是由于商品乳酸菌制劑適宜生長溫度在30℃左右，難以適應西藏高海拔、低溫和缺氧的極端氣候條件，其性能發揮受到了限制。因此發掘和利用青藏高原特有的本土乳酸菌種質資源，發揮其適應性強的特性，對于該地區優質青貯飼料的生產，促進畜牧業的發展具有重要意義。

近年來，國內外有關牧草中附著乳酸菌或青貯飼料中乳酸菌的收集、分離、鑒定及其在青貯飼料生產中的應用備受關注。大部分研究結果表明[5-10]，青貯飼料中分離得到的優良乳酸菌均能明顯改善青貯發酵品質；部分異型乳酸菌還能抑制青貯飼料有氧暴露期間的腐敗變質，提高其有氧穩定性。有關研究報道[2]，在我國高海拔、低溫和缺氧的極端環境中進行牧草青貯時能夠得到優質青貯飼料，幾乎沒有有氧腐敗現象發生，由此可以推測在我國青藏高原地區存在著適應于極端環境的特殊乳酸菌種質資源。

紫花苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)是西藏主要的栽培豆科牧草，具有適應性強、適口性好、蛋白質含量及營養價值高等特點，經常與禾本科牧草以混合青貯方式生產青貯飼料。本研究旨在從西藏豆科牧草青貯飼料中分離生物學特性優良的乳酸菌菌株，從而為西藏青貯飼料添加劑的研發和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

紫花苜蓿和箭筈豌豆種植于西藏日喀則地區草原工作站試驗田(平均海拔3836 m，北緯29°16′，東經88°51′)；該地區屬于高山亞寒帶半干旱季風氣候，年均降雨量為422.4 mm，氣溫6.3℃，日照時數3233 h。紫花苜蓿和箭筈豌豆均處于結莢期，于2013年9月28日刈割，刈割后在田間用鍘刀切成2 cm左右，裝填至實驗室青貯窖中壓實密封，置于室溫條件下保存，分別在青貯第5天，45 d時開窖取樣，對青貯飼料中乳酸菌進行分離鑒定。紫花苜蓿和箭筈豌豆青貯5和45 d各5個重復，共計20個青貯窖；實驗室青貯窖，為容積2 L的圓柱狀塑料容器，有內外兩層蓋，便于密封保存。

1.2 培養基，試劑及主要儀器設備

葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培養基和MRS培養基參考Cai等[6]的方法配制，營養瓊脂培養基，虎紅瓊脂培養基購自南京壽德試驗器材有限公司。

API CHL培養基和API 50 CH試劑條購自法國BioMerieux公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，PCR合成引物由上海英濰捷基生物科技有限公司合成。

主要儀器設備：恒溫培養箱、超凈工作臺、光學顯微鏡(OLMPUS)、立式壓力蒸汽滅菌器、PCR儀、超低溫冰箱、凝膠成像儀、電泳儀、紫外分光光度計(日立，U-2910)、pH計(HANNA pH211型)。

1.3 原材料的微生物成分分析

采用平板培養方法進行微生物計數，在超凈工作臺中采用四分法取原材料樣品10 g，放入90 mL的無菌生理鹽水密封，置于常溫搖床上搖動2 h。用無菌生理鹽水適當稀釋，取3個適宜梯度涂板，每個梯度2個平行。乳酸菌選用MRS培養基，好氧菌選用營養瓊脂培養基，霉菌和酵母菌選用虎紅瓊脂培養基，置于35℃恒溫培養箱中培養2～3 d計數。

1.4 乳酸菌的分離與純化

分別取青貯5 和45 d后的青貯飼料同上述步驟進行稀釋，選用GYP培養基進行乳酸菌的分離培養，挑選具有黃色透明環的菌株分離，在MRS固體培養基上劃線培養，35℃ 2～3 d，重復劃線分離培養3次，得到純化的單菌株。然后根據菌落的顏色、大小、光澤、形狀等選取典型菌株進行革蘭氏染色，油鏡鏡檢，過氧化氫酶試驗；凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步認定為乳酸菌菌株[2]，在MRS液體培養基中富集(35℃ 24 h)后加入等體積40%的甘油，分裝，-20℃保存，備用。

1.5 乳酸菌的生理生化特性檢測

1.5.1 不同溫度水平生長試驗 將配制好的MRS培養液以每試管5 mL的量分裝好，在121℃高壓條件下滅菌15 min，將待測菌株培養液，以相同的接種量(0.1 mL)接入培養液中搖勻，塞子封口，分別置于5，10，15和20℃恒溫培養箱中培養，其中5和10℃培養5～7 d，其余培養3 ～5 d，觀察菌株的生長情況。

1.5.2 不同pH和鹽濃度水平生長試驗 用鹽酸或氫氧化鈉將MRS培養液pH調至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0等7個水平，用分析純NaCl將MRS培養液的鹽濃度調至3.0%和6.5%兩個水平，同上述步驟，將待測菌株培養液以相同的接種量(0.1 mL)接入已滅菌培養液中，置于35℃恒溫培養箱培養2 d后，觀察試驗菌株的耐酸堿能力。

1.5.3 糖發酵試驗 使用包含49種不同碳水化合物和一個對照的API 50 CHL進行不同糖，醇發酵鑒定，在35℃條件下培養48 h后測定發酵結果。具體方法按照試劑盒的說明進行。

1.6 乳酸菌菌株的16S rRNA序列測定

取30℃條件下培養12 h的培養液各1 mL，13000 r/min離心10 min，沉淀物用于DNA提取，具體的操作方法嚴格按照試劑盒說明進行。PCR選用細菌16S rRNA V3區通用引物：27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 r(5′-TACCTTGTTACGACT-3′)。PCR反應體系包括：2×PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應程序為：預變性，94℃，5 min；變性，94℃，30 s；退火，55℃，30 s；延伸，72℃延伸1 min，共35個循環。PCR純化產物送樣測序(上海英濰捷基生物科技有限公司)。

用BLAST將所測定菌株的16S rRNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中已知細菌的16S rRNA序列進行比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，分析相似性。然后用MEGA6.0中的Clustal W對最近類群的序列進行多重比較分析，并通過該軟件的鄰近法(neighbor joining)構建系統發育樹，分支聚類的穩定性用Bootstrap方法進行2000次隨機重復取樣評價[2]。

1.7 優良乳酸菌菌株的篩選與確定

將分離并鑒定的菌株以3%的接種量接入已滅菌的MRS液體培養基中，于35℃恒溫培養箱中培養48 h；每隔4 h取1次樣品，測定培養液的pH值，以培養時間為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制生長曲線；用培養液做空白，在波長600 nm下測定樣品的吸光度值(OD值)，以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 微生物計數

試驗用紫花苜蓿和箭筈豌豆原材料中微生物成分如表1所示。 乳酸菌的數量較少，均為103cfu/g FW，霉菌數量為104cfu/g FW；箭筈豌豆中好氧菌的數量多于紫花苜蓿，達到3.2×107cfu/g FW，但酵母數量低于紫花苜蓿，只有3.0×103cfu/g FW。

2.2 乳酸菌的分離

挑選GYP培養基上具有黃色溶菌環的菌株分離，初步分離出86株乳酸菌菌株進行革蘭氏染色、鏡檢、過氧化氫酶試驗、通過不同溫度、不同pH和耐鹽性試驗的比較，分離得到24株耐低溫、低pH的乳酸菌菌株，再對其進行生長產酸試驗，共得到6株生長迅速、產酸快的優良乳酸菌菌株。菌株來源如表2所示：苜蓿青貯飼料共分離得到3株乳酸菌菌株，早期分離得到AG11，晚期分離得到LAG1和LA3；CG35來自發酵5 d箭筈豌豆青貯飼料，LCG3和LCG9分離于發酵45 d的箭筈豌豆青貯飼料。

表1 苜蓿和箭筈豌豆微生物分析

cfu:Colony forming unit；FW:鮮重Fresh weight.

2.3 乳酸菌的生理生化特性

乳酸菌的表型特征及生理特點如表3所示。6株乳酸菌菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、同型發酵乳酸菌，其中LCG9，CG35和AG11為乳酸球菌；LAG1，LA3和LCG3為乳酸桿菌。AG11和LAG1在5℃生長微弱，10～20℃生長旺盛；其余乳酸菌菌株均能在5～20℃范圍內表現出很強的生長活力。不同pH值和鹽濃度條件下的生長情況為：除LCG9和AG11在pH 3.0，pH 8.0條件下生長微弱外，其余乳酸菌菌株均能在pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0內生長；所有乳酸菌菌株在3.0%和6.5%NaCl條件下生長旺盛，表明分離出的乳酸菌菌株具有耐低溫、耐酸堿和強的耐鹽特性。

乳酸菌菌株的糖發酵試驗結果如表4所示：6株乳酸菌菌株均能利用核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，N-乙酰-葡萄糖胺，熊果苷，七葉靈，麥芽糖和海藻糖產酸。除LA3外，其余乳酸菌菌株均可利用L-阿拉伯糖，苦杏仁甙，纖維二糖和龍膽二糖，微弱利用葡萄糖酸鹽。從利用D-松二糖和山梨醇的情況來看，LAG1，LCG3和LA3可以利用其發酵產酸，但LCG9，CG35和AG11不能；除此之外，LAG1和LCG3能夠發酵甘露醇，α-甲基-D-甘露糖苷，水楊苷，乳糖，蜜二糖，蔗糖，松三糖和D-棉籽糖，而其余乳酸菌菌株不能。

2.4 分離乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列分析

結合圖1系統進化樹和表5分離乳酸菌菌株的16S rRNA序列分析結果可知：LCG9，CG35和AG11與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)的進化親緣度均為100%，LA3與彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)為97%，與對應標準菌序列相似性分別為100%，100%，100%和99.9%；因此，LCG9、CG35和AG11被準確地鑒定為戊糖片球菌，LA3為彎曲乳桿菌。LAG1和LCG3與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳桿菌(Pediococcuspentosaceu)處于同一族群，進化親緣度達到100%，并具有99.9%的序列相似性，故只通過16S rRNA序列比較，無法確定他們的種族。LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3在基因庫中的登錄號分別為：KJ806296，KJ806305，KJ806309，KJ806295，KJ809299和KJ806306。

表2 青貯飼料中分離的乳酸菌菌株

表3 青貯飼料中分離出的乳酸菌的特性

注：“+”陽性，“-”陰性；“W”弱陽性。

Note:“+”positive,“-”negative,“W” weakly positive.

2.5 分離的乳酸菌菌株的產酸及生長特性

分離乳酸菌菌株的產酸速率曲線如圖2所示，LAG1和LCG3的產酸速率最快，它們在0～8 h產酸迅速，8～12 h逐漸變緩，12 h以后趨于平穩。其中LCG3早期產酸最快，培養12 h后，培養液pH降至3.9；16 h之后與LAG1表現出相似的產酸速率。LCG9，CG35，AG11和LA3在整個發酵過程中培養液pH值保持持續緩慢的下降趨勢，在發酵結束48 h時分別達到最低值3.82(LCG9)，3.83(CG35)，3.91(AG11)和3.95(LA3)，pH值均達到4以下，同樣具備較強的產酸能力。

表4 分離出乳酸菌的糖發酵特性

注：“+”生長，“++”生長良好，“-”不生長,“W”微弱生長。

Note:“+”growth,“++”growth well,“-”non-growth,“W”growth weakly.

不同菌株的生長速率曲線見圖3，分離乳酸菌菌株的生長特性均為對數生長曲線；LCG3和LAG1在發酵過程中沒有明顯的遲滯期，培養0～2 h開始進入對數生長期，2～8 h生長速度達到最快，8～10 h開始進入穩定期，16 h OD值分別達到2.512和2.382；在整個培養過程中，LCG3的生長速度最快，這一結果與產酸速率結果基本一致。LCG9，CG35，AG11和LA3生長速率較緩慢，早期培養遲緩期長，但后期培養基中細胞濃度較高，20 h后OD值分別為2.203(LCG9)，2.185(CG35)，2.114(AG11)和2.185(LA3)，也表現出良好的生長特性。

3 討論

乳酸菌數量和活性是抑制不良微生物生長和減少發酵損失的一個重要因素，發酵品質取決于青貯材料上初始乳酸菌數量和底物含量[8]。但自然條件下，植物本身附著的乳酸菌數量較低，而且主要為異型乳酸菌[9]，難以保證青貯發酵品質。Pang等[11]曾報道：保證青貯發酵成功的最低乳酸菌數量為105cfu/g FW，本試驗中，西藏地區箭筈豌豆和紫花苜蓿表面附著乳酸菌的數量均小于104cfu/g FW，不能滿足青貯發酵的最低需求。因此在西藏進行青貯飼料生產時，僅靠材料上附著的乳酸菌進行乳酸發酵，來獲得優質青貯飼料較為困難。這樣，分離青貯飼料中生長迅速、耐酸能力強的優良乳酸菌菌株顯得尤為重要。

圖1 乳酸菌菌株LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3及相關菌種進化樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relative positions of strains LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3，LA3 and related species as inferred by the neighbor-joining method with 16S rRNA gene sequences

在自然青貯過程中，環境溫度是影響乳酸菌活性的重要因素[12]。Cao等[13]在對不同季節的發酵TMR進行研究后發現，冬季的低溫條件限制了乳酸發酵。青藏高原具有海拔高，氣溫低，晝夜溫差大等氣候特點，可能會抑制商品乳酸菌的生長及活性的發揮。Liu等[14]研究發現：商品乳酸菌在20℃條件下生長活性會受到影響，不能很好地發揮作用。但本研究所分離得到的6株乳酸菌均具有較強的耐低溫特性，能夠在5℃條件下生長，在10℃時生長旺盛；其中LCG9，CG35，LCG3和LA3的耐低溫能力較強，在5℃條件下仍生長旺盛。體現了高寒環境分離的乳酸菌對低溫條件具有強的適應特性。

表5 分離出的乳酸菌菌株16S rRNA基因序列分析

圖2 乳酸菌的酸產生速率Fig.2 Acid-production rate of lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria

McDonald等[8]歸納總結了作為理想的青貯接種菌必須滿足的條件為：1)生長旺盛，能夠競爭植物本身所附著的各種菌群；2)為同型發酵乳酸菌，能在盡量短的時間內產生大量乳酸；3)耐酸，能迅速降低pH值，4)可廣泛地利用各種可溶性糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖等。本試驗所分離得到的6株乳酸菌菌株均為同型發酵乳酸菌；生長速度快、產酸能力強，能迅速降低pH值；具有較強的耐酸特性，能夠在pH 3.0條件下生長，pH 3.5時生長旺盛；均滿足理想青貯接種劑的條件。其中LCG3和LAG1的產酸能力最強，但由于LAG1在5℃條件下生長微弱，而LCG3生長旺盛，因此LCG3最適宜于用作西藏地區青貯飼料生產用乳酸菌添加劑菌種。但其余乳酸菌菌株在10℃條件下生長能力強，培養48 h后培養液pH均降至4.0以下，OD值達到2.2左右，同樣具有制備乳酸菌添加劑的潛質。

根據16S rRNA序列分析和系統進化樹，LCG9，CG35和AG11被準確地鑒定為戊糖片球菌；LA3為彎曲乳桿菌。由圖1可知：LAG1和LCG3與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌處于同一族群，且進化親緣度為100%；其中LCG3與植物乳桿菌，戊糖乳桿菌的序列相似性分別為100.0%和99.9%；LAG1分別為99.9%和99.8%。許多研究結果表明[15-18]：植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的16S rRNA序列只有2 bp的差別，表現出很高的序列相似性，故無法確定種族。結合伯杰氏細菌鑒定手冊和其他研究結果[19]：戊糖乳桿菌可以利用L-阿拉伯糖，D-木糖和鼠李糖產酸，植物乳桿菌不利用鼠李糖產酸；Ennahar等[16]曾指出：植物乳桿菌能夠利用松三糖，D-棉籽糖和α-甲基-D-甘露糖苷發酵產酸，但戊糖乳桿菌不能。LCG3和LAG1能利用松三糖，D-棉籽糖，α-甲基-D-甘露糖苷和L-阿拉伯糖發酵產酸，但不利用鼠李糖和D-木糖，故被準確地鑒定為植物乳桿菌。

本試驗分離得到的植物乳桿菌、戊糖片球菌和彎曲乳桿菌均為青貯用常見乳酸菌菌種，這為制備優良的青貯飼料添加劑提供了可能。對于分離所得的乳酸菌菌株能否很好地作為西藏及其他低溫地區青貯用乳酸菌添加劑以及如何確定添加劑量，還需要在后續試驗中做進一步的研究。

4 結論

本研究從西藏地區豆科牧草青貯飼料中分離得到6株優良乳酸菌菌株。經過糖發酵試驗和16S rRNA序列分析，3株為戊糖片球菌，2株為植物乳桿菌，1株為彎曲乳桿菌。6株乳酸菌菌株均為同型發酵乳酸菌，具有耐低溫，耐酸堿，強的耐鹽特性，其中植物乳桿菌LCG3產酸能力最強，發酵速度最快，最適宜于用作青藏高原青貯飼料生產用乳酸菌添加劑。

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Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet

YANG Xiao-Dan1, YUAN Xian-Jun1, GUO Gang1,2, CUI Zhao-Ming1, LI Jun-Feng1, BAI Xi1, BA Sang3, SHAO Tao1*

1.InstituteofEnsilingandProcessingofGrass,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.ThePrairieWorkstationofShigatse,Tibet,Rikze857000,China

The objectives of this study were to identify lactic acid bacteria with desirable attributes by isolating and identifying lactic acid bacteria (LAB) from legume silages in Tibetan Plateau. A total of 6 homofermentiative lactic acid bacteria were isolated from alfalfa (Medicagosativa) and common vetch (Viciasativa) silage. Strains LCG9, CG35 and AG11 were identified asPediococcuspentosaceus, strains LCG3 and LAG1 asLactobacillusplantarumand strain LA3 asLactobacilluscurvatu. Conventional microbial identification methods and 16S rRNA sequencing analyses were used to identify different strains. The selected strains were grown in a range of conditions; temperature 5-20℃, pH 3.0-8.0 and NaCl 3.0% and 6.5%. LCG9 and AG11 grew weakly at 5℃ while LCG9 and AG11 were inactive at pH 3.0 and pH 8.0. LCG3 was identified as the best strain to use as a silage additive in Tibet due to its unique tolerance of low temperature, high lactic acid production and rapid reproductive rate.

Legume grass; silage; lactic acid bacteria; isolation; identification

10.11686/cyxb2014312

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-07-14；改回日期：2014-10-21

中國科學院科技服務網絡計劃(STS計劃)(KFJ-EW-STS-071)，國家星火計劃項目課題(2013GA840003)，“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAC09B03)和農業部成果轉化項目(2013GB2F40046)資助。

楊曉丹(1990-)，女，河南洛陽人，在讀碩士。E-mail: yxd695114957@163.com *通訊作者Corresponding author. E-mail: taoshaolan@163.com

楊曉丹, 原現軍, 郭剛, 崔棹茗, 李君風, 白晰, 巴桑, 邵濤. 西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優良乳酸菌的篩選. 草業學報, 2015, 24(6): 99-107.

Yang X D, Yuan X J, Guo G, Cui Z M, Li J F, Bai X, Ba S, Shao T. Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 99-107.