氨基糖苷類抗生素性耳聾基因治療的研究進展

劉文杰，傅仲鷹

（吉林大學第一醫院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春 130021）

自氨基糖苷類抗生素 （aminogloside antibiotics，AmAn）問世以來，氨基糖苷類抗生素性耳聾 （AmAn induced deafness，AAID）一直困擾著患者，其治療局限于保護殘余聽力、藥物 （非特異性藥物）、高壓氧、配戴助聽器和人工耳蝸植入。AAID治療最根本的目的是使損傷的毛細胞再生并且恢復其功能。研究［1－2］顯示：基因治療是AAID治療的有效方法。同時有研究［3－4］顯示：AmAn對毛細胞的損傷不同于機械性損傷，并且影響AAID基因治療效果的因素錯綜復雜。本研究就AAID基因治療的研究進展進行簡要介紹。

1 AmAn和AAID

20世紀40年代，AmAn問世并應用于臨床。AmAn的殺菌機制主要是藥物結合在細菌的30S核糖體亞基阻礙氨基酸聚合從而干擾細菌的蛋白質合成導致細菌死亡［5］。AmAn因其特殊的抗菌作用和理化特性，目前在多重耐藥結核、肺囊性纖維性病變、嚴重綠膿桿菌和假單胞菌感染、腦膜炎及復雜性院內獲得性急性尿路感染等［6－8］仍然廣泛應用。

AmAn應用于臨床的同時，其耳毒性和腎毒性也引起人們的關注，臨床應用受到限制。AmAn的耳毒性表現在能夠使聽覺毛細胞損傷，造成永久性的聽力喪失。AmAn通過內吞或陽離子通道進入毛細胞［6］。AmAn經毛細胞內吞進入內質網和溶酶體，使溶酶體釋放溶酶體酶或自身崩解，導致細胞死亡。AmAn可以結合Fe3＋，在細胞質中形成Fe2＋－AmAn復合物，這種氧化還原復合物能夠產生活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）［9］。線粒體受到 ROS破壞，釋放細胞色素C（cytochrome C），激活一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）［10］，包括caspase－3、caspase－8、caspase－9，其中caspase－8對細胞膜的細胞死亡因子受體刺激起反應［2］。caspase－9 激 活caspase－3，使ROS水平升高，然后激活絲氨酸蛋白酶（calpains）［11］。Calpain激活后可導致細胞骨架、膜蛋白、各種激酶和磷酸酶以及轉錄因子的徹底崩潰［4］。

2 AAID的基因治療

2.1 AAID與毛細胞再生 20世紀80年代初，Corwin等［12］和 Cruz等［12－13］發現：非哺乳動物的毛細胞損傷后可再生。Bermingham 等［14］和 Brignull等［15］證實：成熟鳥類毛細胞損傷后再生的毛細胞能夠恢復聽覺和平衡功能。經過反復探索，20世紀90年代初，Forge等［1－2］發現：豚鼠毛細胞受AmAn損傷后，耳蝸中能夠再生不成熟的毛細胞。

毛細胞再生的前體細胞來源多樣，根據研究［1－2，12－15，21］可以歸結為以下4個來源：①內耳感覺上皮中的干細胞；②支持細胞通過有絲分裂或直接分化為毛細胞；③受損區旁的毛細胞自我修復；④非感覺區上皮細胞遷移至受損區并分化為毛細胞。

2.2 AAID與線粒體基因突變 一部分AAID患者在應用小劑量或常規劑量的AmAn時出現 “一針致聾”的現象，其聽力呈雙耳對稱性、重度感音神經性耳聾［16］。隨著研究的深入，證實了 “一針致聾”的現象與線粒體基因突變有密切關聯。

線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）具有突變率高和母系遺傳的特點，其中1555A＞G和1494C＞T是常見的引起母系遺傳的非綜合征型聽力損失的突變位點，與AAID發生有密切關聯。目前學者［17］認為：線粒體位于12SrRNA高度保守的解碼區的同質性的A1555G和C1494T發生突變，在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C－G1555或1494U－A1555堿基對，使得12SrRNA在二級結構上與細菌的16SrRNA的相應區域的二級結構更加相似。AmAn與其結合更加容易，因此，攜帶突變基因的人在接觸了該AmAn時會更加容易出現或者加重耳聾。趙芳等［16］通過對AmAn易感的遺傳性耳聾家系系譜分析進一步證實：mtDNA A1555G點突變是AAID遺傳易感性的分子基礎。研究［18］顯示：mtDNAC1494T點突變的細胞株mtDNA編碼蛋白合成減少，ATP產物減少，并且線粒體中ROS水平升高。慶大霉素作用于mtDNAC1494T點突變的細胞株系，更多功能障礙的線粒體發生融合和自噬。

目前發現線粒體的突變位點除1555A＞G和1494C＞T外，還有961insC、1095T＞C、961T＞G、1291T＞C和827A＞G都與藥物性耳聾有關聯［19］。

2.3 AAID和Atoh1基因 Atoh1基因即Math1基因，是現在應用最廣泛及研究最深入的轉錄因子，屬于堿性螺旋－環－螺旋轉錄因子 （basic helix－loop－helix，bHLH）家族，在多種組織中廣泛表達。在內耳的發育過程中，雖然Atoh1在前體細胞中處于低轉錄水平，但對哺乳動物聽覺毛細胞的生長發育是必需的。

Pan等［20］采用Pax2－Cre去掉小鼠胚胎時期內耳的Atoh1基因發現：出生后小鼠的柯蒂氏器會因缺乏Atoh1基因而致支持細胞數量減少、毛細胞未分化及輸入和輸出神經纖維大部分缺失，證明Atoh1在內耳發育及分化中的重要作用。近年來多項研究表明Atoh1能夠使AAID損傷的毛細胞再生，并且恢復內耳的部分功能：Patrick等［21］采用攜帶Atoh1基因的腺病毒轉染全聾的成年豚鼠的柯蒂氏器，3周后發現與未經治療一側比較毛細胞明顯增多，聽覺功能部分恢復。該研究結果表明：Atoh1基因治療AAID可能通過殘余毛細胞自身修復和促進支持細胞直接分化為毛細胞2種方式來增加毛細胞的數量。Lzumikawa等［22］過表達Atoh1基因治療AmAn致聾的豚鼠，8周后不僅毛細胞再生，并且聽力水平也得到提高。

2.4 AAID 和其他相關基因 Atoh1基因［21－22］在支持細胞中過表達能夠促進支持細胞分化為毛細胞，而支持細胞不僅僅只表達 Atoh1基因，除 Atoh1外，Hes1、Hes5、MYC、Jagged2、Pax2和Sox2等都影響支持細胞的增殖和分化。

Hes1和Hes5基因負性調節Atoh1基因表達，從而阻礙支持細胞分化為毛細胞［23］。Du等［24］發現：出生3d的小鼠柯蒂氏器經AmAn作用毛細胞缺失，運用siRNA阻斷Hes1或Hes5表達，支持細胞能夠分化為毛細胞。MYC基因家族調節耳部發育，感覺細胞和非感覺細胞的合理分化，c－Myc基因能夠使支持細胞重新進入有絲分裂［25］。Jagged2是Notch通路的配體，在聽覺和前庭器官正常發育中起重要作用，去除Jagged2，支持細胞分化為毛細胞［26］。Pax2（Paired box 2）是Paired box基因家族的一員，在雞和鼠聽覺及前庭感覺原基及內淋巴管中表達，在內耳發育中起重要作用，Pax2基因融合可導致聽覺及前庭器官缺陷。Chen等［27］發現：體外培養的新生小鼠柯蒂氏器，在新霉素作用24h后毛細胞缺失，使用腺病毒共表達Pax2和Math1基因轉染柯蒂氏器上皮細胞，能夠促進支持細胞在原先位置增殖、分化為毛細胞，并且獲得一定的功能。Sox2是一種高遷移率家族轉錄因子，在保持細胞多能性及再生能力起關鍵作用，在哺乳動物聽覺及前庭支持細胞內表達，可能與支持細胞細胞潛在的持續的自身更新及有絲分裂有關聯［28］。

2.5 AAID和Notch信號通路 Notch信號通路［23］在內耳的發育中起關鍵作用，能夠決定內耳感覺器官發育的部位，并且使毛細胞及其周圍的支持細胞鑲嵌分布，通過接觸抑制控制兩者的增殖和分化。毛細胞表達Notch配體Delta1和Jagged2，與相鄰支持細胞的Notch受體相互作用，Notch蛋白通過3次剪切，釋放NICD，使轉錄調節因子Hes1和Hes5表達上調，抑制Atoh1基因表達，從而抑制毛細胞和支持細胞的增殖和分化。

Korrapati等［29］通過慶大霉素誘導新生小鼠耳蝸毛細胞缺失，支持細胞形態發生變化，填補毛細胞死亡時殘留的裂隙，此時Notch信號通路表達活躍，以不依賴毛細胞的轉錄調節因子Hes1、Hey1、Hey2、HeyL和Sox2作為目標和潛在的Notch效應器。Notch信號通路抑制劑——γ－分泌酶抑制劑能夠使支持細胞分化為毛細胞樣細胞，該毛細胞樣細胞的細胞學、分子學和基本的電生理學特性與成熟的毛細胞相似。Zhao等［30］運用 DAPT——γ－分泌酶抑制劑，同時過表達Atoh1，培養新生大鼠柯蒂氏器，誘導大量新生毛細胞。

2.6 細胞周期調控 細胞周期蛋白D（cyclinD，cD）在細胞周期調控中起重要作用，能夠使哺乳動物毛細胞的細胞周期處于靜止期［31］。cD1是影響支持細胞增殖的重要因素，支持細胞增殖能力下降與cD1表達減少有關聯，過表達cD1能夠刺激支持細胞進入細胞周期而增殖。Loponen等［32］將攜帶cyclinD1的腺病毒導入小鼠成熟的支持細胞中，異常表達的cyclinD1能夠使支持細胞重新進入細胞周期，細胞周期蛋白依賴的激酶抑制因子 （cyclin dependent kinase inhibitors，Ckis）包括2個家族［33］：Ink4家族和 Cip／Kip 家族。Ink4家族包括p15Ink4a、p16Ink4b、p18Ink4c和 p19Ink4d，Cip／Kip 家族包括 p21Cip1、p27Kip1和p57Kip2多肽。p27kip1基因能夠使哺乳動物毛細胞細胞周期處于靜止期，下調P27kip1能夠促進支持細胞的增殖，并且少數支持細胞可分化為毛細胞［34］。

細胞周期負調控因子還有視網膜母細胞瘤蛋白（rentinoblastoma protein，pRb）。pRb是口袋蛋白，可抑制毛細胞進入細胞分裂期。Yu等［35］運用Prox1－CreER （T2）法去掉新生小鼠耳蝸支持細胞中的pRb，支持細胞重新進入細胞周期，進行有絲分裂。

3 展 望

臨床實際應用中如必須要使用AmAn來治療一些難治性、復雜性的疾病［3－5］時，為了避免AmAn的耳毒性，除了要合理用藥，還要采取措施進行預防。AAID的發生是環境和遺傳共同造成［18－19］。根據AAID的發生機制，可以通過消除細胞中產生的自由基、保護線粒體的功能及其完整性、抑制凋亡通路和基因檢測等方法預防AAID的發生。AmAn使毛細胞中ROS水平升高，金屬螯合劑可以減輕細胞中ROS對線粒體的損傷［7］。Ding等［9］研究顯示：亮抑酶肽能夠減輕慶大霉素對毛細胞的損傷。Tabuchi等［36］發現：X連鎖凋亡抑制蛋白能夠抑制caspase的活動，減輕慶大霉素對毛細胞的損傷作用。線粒體基因存在1555A＞G、1494C＞T、961insC、1095T＞C、961T＞G、1291T＞C和827A＞G等點突變的人群可能對AmAn具有易感性，因此可根據家族中AAID的發生情況進行基因檢測。存在mtDNA基因突變的人群，應避免接觸AmAn［16－19］。

AAID的基因治療是一個錯綜復雜的過程，基因表達、凋亡信號通、細胞周期蛋白和調節因子相互協調，相互制約，共同作用于毛細胞的再生及發育過程，任何一個環節均會影響治療的效果。Atoh1基因在毛細胞再生過程中起關鍵作用，其轉錄受Notch信號通路的抑制［23］。研究［30］表明：單純過表達Atoh1并不能夠使得大多數支持細胞分化為毛細胞，同時抑制Notch信號通路能夠促進新生小鼠毛細胞樣細胞的再生。DAPT和Atoh1基因過表達作用的部位不完全相同，DAPT在柯蒂氏器頂回誘導更多的毛細胞，Atoh1基因過表達使中回產生更多的毛細胞。細胞周期蛋白D與Ckis在細胞分化、發育、轉移和調控細胞周期中共同起關鍵作用。在成熟小鼠支持細胞內過表達cyclinD1，僅有少數支持細胞能夠進入細胞周期，支持細胞中p27Kip1表達減弱，可能與cyclinD1共同促進其重新進入細胞周期［32］。研究［31］顯示：19Ink4d／p21Cip1雙基因敲除新生小鼠的前庭毛細胞體外培養后，cyclinD1異常表達，毛細胞重新進入S期。Rb蛋白去活性并過表達atoh1基因促進新生小鼠毛細胞再生［35］。

諸多學者研究AAID基因治療的方法為本文作者進一步的探索提供了思路。在AmAn損傷毛細胞研究中，基因重新表達使毛細胞再生至功能恢復的每個環節中的影響因素都需要考慮，以期能夠發現一種效果最好的治療方式。但是影響基因治療的很多因素仍然未知，如AAID基因治療的時間窗，目的基因能否正確安全地導入靶細胞，能否在正確部位表達所需蛋白，能否形成有功能的毛細胞，神經纖維與新生毛細胞能否準確構建傳入傳出系統，聽覺功能能否恢復至正常水平等。因此，如何能夠安全有效地達到AAID基因治療的目的是一個漫長的探索過程，還需要進一步研究。

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