SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠快速銀染方法的建立

李建武，李 寧

（1.甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730 0 70；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730 0 70)

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）由Raymond和Weintraub[1]建立，是分析蛋白質和核酸的一種常用的電泳方法。由于其具有上樣量少、不易擴散、分辨率高且易于觀察的特點，在分子生物學及相關學科的基礎和臨床研究中得以廣泛的應用。目前該方法已經廣泛應用于遺傳圖譜構建等過程中AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、 SSR（Simple sequence repeats）等分子標記的檢測[2-5]。

目前常規的聚丙烯酰胺凝膠的銀染過程耗時長，步驟繁瑣，大批量的試驗不僅費時、費力，且存在染色時間較長或分辨率較低等方面的缺點。為了提高分子標記等試驗的效率，利用相同的SSR-PCR產物進行電泳，對文獻報道的4種方法[4,6-8]與在An等[8]方法基礎上改良的銀染方法進行比較，經反復摸索、改良，建立了一種高效、快速的變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所西北旱作馬鈴薯觀測實驗站采集馬鈴薯20份株系的幼嫩葉片，保存在冰盒中，帶回實驗室采用北京天根生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取葉片基因組DNA。

1.2 PCR擴增體系和程序

采用SSR-PCR產物來比較分析各種染色方法的效果，引物參考Ghislain等[9]發表的引物STI 034，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下。

正向引物序列：5'-CAAGAAACCAAGAGCAAAT TTCA-3'；反向引物序列：5'-TGGCGAATGTGAGAA ACAAA-3'。

PCR反應體系：采用20 μL反應體系，1.5 μL 10×Buffer，0.75 μL dNTP（2.5 mM/L），3 μL DNA（20 μmoL/μL），1.2 μL正向和反向引物（10 mM/L），0.3 μL Taq酶（5U/μL），加ddH2O至體積20 μL。

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min，10℃保存。擴增反應在Bio-T100 PCR儀上進行。

1.3 電 泳

SSR-PCR產物加1/2體積的變性上樣緩沖液混合，經95℃變性5 min后置于冰上冷卻停止反應，上樣量為2.5 μL，采用6%（29:1）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增片段，穩壓1 380 V，電泳120 min，電泳結束后銀染顯色、拍照。

1.4 銀 染

采用5種銀染方法，其中參考文獻方法4種，試驗改良方法1種，各銀染方法步驟見表1，銀染試驗重復2次，試驗用水全部采用實驗室制作的蒸餾水。

表1 變性聚丙烯酰胺凝膠各銀染方法操作過程Table 1 Silver staining methods of polyacrylamide gel

1.5 統計拍照

將銀染的玻璃膠板晾干后放置在白熾燈箱上，按照點樣順序逐條對多態性進行比對，在出現差異譜帶的地方進行記錄，有記為1，無則記為0，不清楚記為“-”，使用數碼照相機拍照保存。

2 結果與分析

2.1 不同銀染方法的染色效果比較

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法銀染結果見圖1～5。從圖中可以看出，銀染方法2、3的銀染結果背景較深，但方法2、3、4擴增目標片段較為模糊，不夠清晰，不利于條帶多態性統計；方法1的銀染結果背景淺，目標片段清晰，便于條帶統計，且條帶信息豐富，效果最好。方法5的銀染結果背景較淺，呈淺黃色，目標片段較為清晰，便于條帶統計。

圖1 方法1的銀染結果Figure 1 Silver staining results for method 1

圖2 方法2的銀染結果Figure 2 Silver staining results for method 2

圖3 方法3的銀染結果Figure 3 Silver staining results for method 3

圖4 方法4的銀染結果Figure 4 Silver staining results for method 4

圖5 方法5的銀染結果Figure 5 Silver staining results for method 5

2.2 不同銀染方法所需試劑

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法所需試劑如表2所示。所有操作過程均在1 000 mL蒸餾水溶液中進行。

從表2中可以看出，銀染方法1、2所用的冰乙酸、AgNO3和NaOH的用量都比其他方法的用量多，尤其是比較昂貴的AgNO3用量達到了2 g，造成試劑的很大浪費，加大了試驗成本。銀染方法4用了大量的HNO3，危險性高，不利于操作人員的健康。銀染方法3不使用無水乙醇、冰乙酸、HNO3和Na2CO3，是參試方法中試劑用量最少的方法，成本最低。銀染方法5降低了部分試劑的使用量，同時減少了對人的傷害和對環境的污染，降低了試驗成本。

2.3 不同銀染方法所需時間

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法所需時間如表3所示。通過表3可知，銀染方法1、2、3都耗費了很長的時間，在大批量銀染實際操作中是不可取的。銀染方法4操作過程需要10 min，耗時最短，銀染方法5耗時12 min，這2種方法較其他方法節省了時間，易于批量操作。

表2 5種銀染方法所需的各種試劑數量Table 2 Reagents used in five silver staining methods

表3 5種銀染方法所需時間Table 3 Time needed for five silver staining methods

表4 5種銀染方法的綜合比較Table 4 Comprehensive comparison of five silver staining methods

2.4 不同銀染方法的綜合比較

對變性聚丙烯酰胺凝膠5種銀染方法的操作時間長短、染色背景深淺、目標片段清晰程度、操作步驟、染色/顯影液制作和溫度條件方面進行綜合比較分析（表4）。銀染方法1用時長，染色效果最好，但顯影過程必須在55℃下進行，顯影水溶液溫度不易控制，操作繁瑣。銀染方法2、3耗時長，銀染方法4的染色/顯影液不能長期保存反復使用。銀染方法5操作耗時少，操作簡單，顯影出的膠板背景顏色深，條帶較清晰，便于觀察、記錄，適宜批量操作。

3 討論

近年來，隨著分子標記技術的日益成熟和數量遺傳學統計分析軟件的不斷更新，開展遺傳連鎖圖譜構建、基因定位等研究均需要較大規模的群體為基礎，樣品數量多，若想提高整個研究的效率，首先必須從提高DNA提取效率及后續變性PAGE電泳、染色等步驟的效率著手。變性聚丙烯酰胺凝膠銀染顯色整個過程需要固定、銀染、漂洗、顯影、終止等多個環節，常規的顯色方法需要花費較長的時間。本研究以得到理想的目的片段為前提條件，以縮短顯色染色時間、簡化操作過程、降低研究成本和提高銀染效率為目的。

銀染過程容易受試劑純度、外界溫度、水、操作時間等因素影響，研究統一使用實驗室制作的蒸餾水，國產分析純試劑，可能影響了部分銀染方法的染色效果。銀染方法1（Byun等[6]方法），背景較深，條帶清晰，便于統計，但其染色時間長，整個染色過程需要30 min以上，顯影液需要保持在55℃，過程繁瑣，操作難度大。銀染方法2（梁宏偉等[4]方法）與銀染方法4（An等[8]方法），操作簡單，但條帶模糊，不便統計分析。銀染方法3（高東等[7]方法），條帶清晰程度較差，染色時間較長。改良方法是在An等[8]方法基礎上通過減少染色和顯影試劑使用量，延長反應時間取得了較好的銀染效果。研究改良的高效快速銀染方法與常規方法相比，不僅縮短了工作時間，提高了試驗效率，還節約了部分化學試劑的種類及用量，降低了試驗成本，且取得了可與常規方法相媲美的效果。綜上所述，優化后的銀染方法可滿足變性聚丙烯酰胺凝膠快速銀染要求。

[1] Raymond S,Weintraub L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis[J].Science,1959,130(3377):711.

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[3] Ruiz C,Paz B M,Asins M J.A quick methodology to identify sexual seedlings in citrus breeding programs using SSR markers[J]. Euphytica,2000,112(1):89-94.

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[5]牛楠,陸丹,李瑩.高粱微衛星兩種PAGE銀染方法的比較[J].沈陽師范大學學報:自然科學版,2010(2):259-261.

[6]Byun S,Fang Q,Zhou H,et a1.An effective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry,2009,385(1):174-175.

[7] 高東,杜飛,朱有勇.低背景、高分辨率PAGE簡易銀染法[J].遺傳,2009,31(6):668-673.

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[9] Ghislain M,Nú?ez J,Herrera M R,et a1.Robust and highly informative microsatellite-based genetic identity kit for potato[J]. Molecular Breeding,2009,23(3):377-388.