小腸黏膜下層細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞平滑肌細(xì)胞構(gòu)建組織工程血管的初步研究*

王 飛，魏紅芳，胡成棟，張恩錄，高愛芹，王 瑞，李東風(fēng)

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院：1.骨科；2.麻醉科 056001)

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·臨床研究·

小腸黏膜下層細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞平滑肌細(xì)胞構(gòu)建組織工程血管的初步研究*

王 飛1，魏紅芳2，胡成棟1，張恩錄1，高愛芹1，王 瑞1，李東風(fēng)1

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院：1.骨科；2.麻醉科 056001)

目的 初步探究小腸黏膜下層(SIS)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞構(gòu)建組織工程血管的實(shí)驗(yàn)方法、條件及可行性。方法 取20只家兔(6～8周大)，于體外分離培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞并標(biāo)記，最后進(jìn)行組織工程化血管的自體移植。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明于培養(yǎng)板中合成的支架材料呈現(xiàn)為白色、均勻質(zhì)地；內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞可較好附著并植入SIS材料。結(jié)論 小腸SIS及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞構(gòu)建組織工程血管具有可行性，并具有十分重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

小腸黏膜； 下層細(xì)胞； 內(nèi)皮細(xì)胞； 平滑肌細(xì)胞

天然血管具備天然成分及結(jié)構(gòu)并具有良好的生物相容性，可以提供細(xì)胞需要的各種信號(hào)[1]，同時(shí)也可以有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附和保留分化功能。因此，天然血管是組織工程血管支架的最佳材料。小腸黏膜下層(SIS)是天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料，通常由豬小腸制備，人工處理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ膠原構(gòu)成，制備的SIS厚度約80 μm，具有無免疫原性、抗微生物活性、優(yōu)良的生物力學(xué)性能，并能促進(jìn)組織再生，是組織工程細(xì)胞外基質(zhì)很有前途的生物材料[2-3]。在此基礎(chǔ)上，以異種SIS為細(xì)胞外基質(zhì)預(yù)構(gòu)成三維管道，將內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞在三維管道上聯(lián)合培養(yǎng)，復(fù)合構(gòu)建組織工程化血管的設(shè)想，在國內(nèi)外雜志未見相關(guān)報(bào)道，其可行性值得探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只6～8周家兔；主要的試劑：乙二胺四乙酸(EDTA)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、含氯化鈉(NaCl)的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液、含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液、膠原酶、乙酰膽堿、氯化鉀及硝普鈉等；主要的儀器：F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、光鏡、掃描電鏡熒光顯微鏡或細(xì)胞流式儀等。

1.2 方法

1.2.1 豬小腸黏膜下層的制備與檢測 (1)制備：取健康豬的空腸長約10 cm，沖凈，機(jī)械法去除外面的漿膜層與肌層，翻轉(zhuǎn)后去除黏膜層，縱向切開黏膜下層基質(zhì)，浸泡于100 mmol/L EDTA與10 mmol/L NaOH(pH 11～12)溶液中，去離子水沖凈；再浸泡于1 mol/L HCl與1 mol/L NaCl溶液中6～8 h，去離子水沖凈，在含1 mol/L NaCl的PBS溶液(pH7.0～7.4)中浸泡16 h，去離子水沖凈，在PBS溶液中浸泡2 h，去離子水沖洗2 h，0.2%過氧乙酸(含5%無水乙醇)消毒30 min，在含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，用2.5×10-5Gy γ射線照射。(2)光化學(xué)交聯(lián)劑固定處理后，進(jìn)行光鏡、掃描電鏡及免疫組化檢測，驗(yàn)證其脫細(xì)胞情況。(3)由于SIS黏膜面較漿膜面有更低的孔隙率，因此將SIS黏膜面朝內(nèi)包繞細(xì)玻璃棒上，于顯微鏡下應(yīng)用9/0無創(chuàng)線縫合出直徑為2 mm、長約20 mm管狀基質(zhì)，在體外檢測其生物力學(xué)性能，包括平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應(yīng)力。處理后的管狀脫細(xì)胞基質(zhì)以玻璃化法保存。

1.2.2 豬小腸黏膜下層基質(zhì)抗原性檢測 將處理后的豬小腸黏膜細(xì)胞基質(zhì)，切取1 cm2植入家兔皮下組織，7 d后取材，于光鏡、免疫組化檢測脫細(xì)胞基質(zhì)在家兔體內(nèi)的免疫反應(yīng)情況。如有條件可行單克隆抗體檢測家兔單核淋巴細(xì)胞黏附蛋白(CD18)。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) (1)無菌條件下取家兔自體大隱靜脈，去污，膠原酶灌流消化，采集內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用熒光顯微鏡或細(xì)胞流式儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定；(2)采用類似方法對平滑肌細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)與鑒定。

1.2.4 內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞種植與擬生態(tài)環(huán)境下培養(yǎng) (1) 取傳代培養(yǎng)2～3代的內(nèi)皮細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心漂洗后，種植內(nèi)皮細(xì)胞于1 cm2的豬SIS基質(zhì)上，培養(yǎng)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞能否在此基質(zhì)上成活。(2)生態(tài)環(huán)境動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器的制備：血管細(xì)胞在生理?xiàng)l件下，受到流體切變應(yīng)力、管壁舒縮產(chǎn)生的牽張應(yīng)力以及靜水壓等應(yīng)力，這些應(yīng)力環(huán)境對于血管細(xì)胞的形態(tài)、增殖、極性及基質(zhì)構(gòu)成與結(jié)構(gòu)有著重要影響。參考相關(guān)資料，制備簡便有效、適于血管灌注培養(yǎng)的動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器。(3)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞種植：取2 cm制備好的直徑為2 mm管狀SIS基質(zhì)置于反應(yīng)器內(nèi)，接種內(nèi)皮細(xì)胞，在37 ℃與5%CO2條件下孵化，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)液灌注，第2天應(yīng)用微型注射器將平滑肌細(xì)胞多點(diǎn)隨機(jī)注射入管狀脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)，繼續(xù)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)4周。培養(yǎng)期間，定期進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)、光鏡、電鏡及免疫組化檢測基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞量及活性。

1.2.5 組織工程化血管生物學(xué)及生物力學(xué)性能檢測 (1)應(yīng)用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動(dòng)脈與工程化血管間生物學(xué)方面的差別；(2)檢測正常股動(dòng)脈與工程化血管平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應(yīng)力，比較SIS基質(zhì)、正常股動(dòng)脈、工程化血管三者間生物力學(xué)方面的差別；(3)通過光鏡、電鏡及免疫組化檢測，比較正常股動(dòng)脈與工程化血管二者形態(tài)學(xué)方面的差別。

1.2.6 組織工程化血管的自體移植 (1)管狀SIS基質(zhì)種植細(xì)胞后2周，經(jīng)鑒定細(xì)胞成活后，分別取自體股動(dòng)脈及管狀SIS基質(zhì)為對照，行工程化血管移植(均不行全身抗凝藥物治療)，于1、2、4、8周定期取材，應(yīng)用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動(dòng)脈與工程化血管間生物學(xué)方面的差別；并行大體、光鏡、電鏡及免疫組化檢測，觀察其血管通暢率、形態(tài)學(xué)及免疫相容性，以確定其可行性。(2)取管狀SIS基質(zhì)行血管替代，以自身為對照(均不行全身抗凝藥物治療)，定期取材檢測，在血管通暢率、形態(tài)學(xué)及免疫相容性等方面，與組織工程血管相比較。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察結(jié)果 于培養(yǎng)板中合成的支架材料呈現(xiàn)為白色、均勻質(zhì)地，所合成的組織工程管形支架材料，外徑大小為6 mm，內(nèi)徑大小4 mm，長度為3 cm左右，且有韌性及彈性。

2.2 接種時(shí)細(xì)胞形態(tài)的觀察結(jié)果 貼附于SIS材料上的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞經(jīng)倒置顯微鏡觀察顯示為細(xì)胞胞體透亮，呈現(xiàn)為球形并均勻地分布在SIS材料表面。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果 SMA抗染色體觀察的結(jié)果顯示：內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞能夠滲透于SIS材料之中，并最終形成數(shù)層有規(guī)律的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

3 討 論

目前全世界每年大約有20萬例周圍血管移植，自體血管移植是迄今最理想的替代物，但由于：(1)自體靜脈血管本身結(jié)構(gòu)上與動(dòng)脈存在差異；(2)靜脈本身具有較高的病變率；(3)長度與來源合適的自體非必需血管來源有限；(4)以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的治療模式增加患者痛苦等缺點(diǎn)，而限制其應(yīng)用[4]。人工合成材料的發(fā)展使人工大血管的替代成為現(xiàn)實(shí)，但材料生物相容性與血管順應(yīng)性差、昂貴的價(jià)格、抗凝藥物長期應(yīng)用的不良反應(yīng)以及小管徑血管通暢率很低等條件，使其仍需不斷改進(jìn)[5]。組織工程技術(shù)在血管方面的應(yīng)用，以其高度組織相容性、抗凝性、抗感染及可生長性，為血管的替代與重建展示了美好的前景[6-8]。但是在種植細(xì)胞的研究、細(xì)胞外基質(zhì)以及病損組織替代等方面仍有諸多問題急需解決。

Matsumoto于1967年首先提出應(yīng)用SIS作為血管組織補(bǔ)片后，各國學(xué)者就開始不斷探索SIS作為血管移植物的研究。相關(guān)研究表明：(1)SIS血管較ePTFE有更強(qiáng)的抗感染力，其浸提液能夠抑制多種細(xì)菌生長[9]；(2) SIS有比自體血管更強(qiáng)的再生能力，雖然血管順應(yīng)性無明顯變化，但2個(gè)月后SIS移植物壁厚較原來增厚10倍以上，隨著SIS退變與吸收，按照血管生理與力學(xué)的要求不斷改造[10]；(3)SIS對于5～8 mm口徑血管進(jìn)行移植后，生物力學(xué)檢測顯示移植物獲得力學(xué)重建；(4)以SIS為體外細(xì)胞培養(yǎng)底物，對6種細(xì)胞進(jìn)行不同形式的培養(yǎng)，結(jié)果顯示聯(lián)合三維培養(yǎng)更有利于再現(xiàn)細(xì)胞生理特性[11]；(5)SIS在縱軸方向的抗拉強(qiáng)度為肌腱與韌帶的1/7～1/14，并且彈性大，適于作為血管的替代材料等[12]。

綜上所述，SIS及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞構(gòu)建組織工程具有可行性，并具有十分重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

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河北省邯鄲市科技計(jì)劃項(xiàng)目(1223108090-3)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.033

A

1672-9455(2015)04-0517-02

2014-06-09

2014-09-16)