豬圓環病疫苗的研究進展

李天芝，于新友，沈志強，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

豬圓環病疫苗的研究進展

李天芝1，于新友1，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

豬圓環病毒(Porcine Circovirus，PCV)是圓環病毒科(Circoviridae)、動物圓環病毒屬的成員。該病毒科是國際病毒分類委員會(ICTV)第6次學術報告會新命名的一個科，是已知能自行復制的最小的哺乳動物病毒。PCV可以分為PCV1和PCV2兩種血清型。PCV1無致病性，但廣泛存在豬體內及豬源代細胞系，1974年，Tischer首次從PK-15豬腎傳代細胞系中分離。PCV2具有致病性，該病主要以進行性消瘦和多系統病理損傷為特征，可引起斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現黃疸現象，剖檢后發現有淋巴結腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質性肺炎和腎炎，給養豬業造相當嚴重的經濟損失。1991年，在加拿大首次暴發該病，隨后，世界各國家和地區都有該病的報道，并在患斷奶仔豬多系統衰竭綜合征 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(Porcine Dermatitisand Nephropathy Syndrome，PDNS)等病豬體內分離到PCV2，并證明PCV2與這些嚴重威脅著養豬業的疾病密切相關。目前該病毒引起了國內外獸醫界的廣泛關注。

1 流行特點

豬是PCV2的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的豬最易感，尤其是5～12周齡的仔豬，一般于斷奶后2～3天開始發病，急性發病豬群中，病死率可達10%，在疾病流行感染過的豬群中，發病率和死亡率都較低，如果并發或繼發細菌或病毒感染可使死亡率大大增加。豬皮炎與腎病綜合征一般為散發，豬只在斷奶后2～3天發病，不發燒或者輕微發燒，精神沉郁，會陰部、腹部皮下水腫，滲出性皮炎，腎臟極度腫大，病程短，多數在發病后三天內死亡。雖然許多國家和地區的豬群中存在豬II型圓環病毒(PCV2)和由它引發的疾病，但是各國的流行狀況之間存在很大差異。加拿大是首次報道PMWS的國家，但時至今日，多數農場的豬群中仍然只是散發，很少呈流行性發生PMWS，但是與PCV2有關的PNDS、心肌炎和繁殖障礙綜合征等疾病正引起了人們更多的關注。

2 疫苗研究進展

2.1 滅活疫苗

采用人工培養大量繁殖免疫原性好的病原微生物，滅活、濃縮后按一定比例加入佐劑制成的疫苗，稱為滅活疫苗，該疫苗可由病原微生物的完整個體組成，也可由其某些片段組成。滅活疫苗具有無毒、無害、效果穩定的優勢。國、內外對豬圓環病毒滅活疫苗的研究已取得了巨大進展。法國梅利亞公司研究、開發的PCV2油包水乳劑滅活疫苗，在歐洲一些國家已注冊上市，免疫后備母豬或經產母豬，仔豬可通過母源抗體獲得保護，實驗和臨床證明，該疫苗有較好的效果，可減少感染、排毒，減輕臨床癥狀。國內現有3種自主研發的豬圓環病毒常規滅活疫苗獲準生產上市，其中PCV2滅活疫苗LG株由哈爾濱獸醫研究所研制，該產品免疫應答快，效果好。另有南京農業大學研發的PCV2滅活疫苗SH株和北京大北農集團研制的PCV2滅活疫苗DBN-SX07株。

2.2 弱毒疫苗

采用抗原性好的無毒株、天然弱毒株或人工誘變的弱毒株制成的疫苗稱為弱毒疫苗，該類疫苗具有不少優點如接種數量少，可刺激機體產生細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺點如可能會發生毒力返強，儲存和運輸需在冷凍條件下，易失活，易被細菌污染等。Fenaux等將PCV2于PK-15細胞上傳120代，結果120代病毒比初代病毒滴度高出一個log單位，同時，傳30代后Cap基因110位脯氨酸變為丙氨酸(P110A)并維持到120代，此外191位精氨酸變為絲氨酸(R191S)，突變毒株在豬體內的接種實驗表明，PCV2120代病毒血癥時間和豬血清病毒含量明顯低于第1代，即PCV2120代明顯致弱。也有人將PCV2的ORF2克隆到缺失ORF2的PCV1的骨架中，得到PCV1-2嵌合型病毒。研究表明，該嵌合型病毒是減毒的，能刺激機體產生特異性免疫反應，可作為制備PCV弱毒疫苗的優勢毒株，且具備不易發生毒力返強的優勢。

2.3 亞單位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機體產生特異性免疫應答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。Zhou等首次在大腸桿菌中對缺失了核定位信號序列(NLS)的PCV2 cap蛋白(dCap)與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)進行了融合表達，獲得了rGST-dCap蛋白，實驗證明，純化的rGST-dCap蛋白以及去掉GST的rdCap蛋白，均可與抗PCV2豬血清發生特異性反應。用rdCap蛋白制備的單抗，可與感染PK15細胞的病毒粒子以及在PK15細胞中表達的Cap蛋白發生反應，同時表現對PCV2病毒粒子的中和活性。付玉潔等為評價豬圓環病毒(PCV)2a/2b兩種基因型病毒株及其重組Cap蛋白 (rCap)之間的交互免疫，采用重組桿狀病毒表達的2種Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。免疫小鼠后進行攻毒，結果，以PCV2a和PCV2b各為指示病毒對病毒抗血清和rCap蛋白抗血清進行交叉中和試驗，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價均高于異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見明顯病理變化，攻毒對照鼠肺臟出現一定程度的病理損傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達的重組PCV2-Cap蛋白制備亞單位疫苗，免疫BALB/c鼠測定其抗體、中和抗體。結果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護效果，能夠有效誘導小鼠產生明顯的體液免疫應答。

2.4 核酸疫苗

構建含有外源抗原基因的重組質粒，免疫動物后，表達的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結合，刺激機體產生特異性免疫應答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。Kamstrup等為了進一步探索衣殼蛋白免疫預防的適用性，采用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表達載體克隆了PCV2的ORF2基因，并證實了此質粒能夠在體外(通過直接表達蛋白)以及體內(通過對小鼠用基因槍注射質粒，誘導小鼠免疫產生抗體)進行表達。免疫試驗結果表明，所構建的核酸疫苗均能誘導小鼠產生一定的體液免疫和細胞免疫反應。金寧一等以pVAX1為載體，構建了表達PCV2 ORF1、ORF2和豬IL-18的核酸疫苗 pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1、pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等。用這些核酸疫苗免疫6～8周齡小鼠，結果表明，所構建的核酸疫苗均能誘導小鼠產生一定的體液免疫和細胞免疫反應，其中核酸疫苗pVAX1-IL18-ORF2-ORF1免疫效果優于其他幾種疫苗。宋云峰等將ORF2基因克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建了pc-ORF2作為核酸疫苗免疫小鼠。同時將具有蛋白轉導功能的BVP22基因分別克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表達，肌肉注射免疫接種Balb/c小鼠，結果顯示，通過兩次免疫后，各疫苗組均產生了針對ORF2的體液抗體，同時證明BVP22可增強核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，為防控豬圓環病毒II型感染提供了較為理想的侯選疫苗。BlanchardP等研究了PCV2基因疫苗及亞單位苗的免疫效力，仔豬用ORF2和 GM-CSF表達質粒首免，2周后用ORF2和GM-CSF表達質粒以及ORF2蛋白二免，免疫豬可抵抗PCV2的攻擊，表明ORF2可誘導機體產生免疫保護。但通過比較，單獨用PCV2基因疫苗兩次免疫的效果低于亞單位苗的效果，不能完全抑制PCV2的增殖。Aravindaram等用構建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3的3種重組質粒單獨或聯合免疫小鼠，2周后加強免疫，結果發現ORF2/3與ORFl/2/3這2種質粒組合免疫后PCV2病毒載量顯著減少，誘導產生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2抗體水平均高于其他免疫組，小鼠的肺部病變也明顯減輕。史小紅等將重組真核表達質粒pcDNA-ORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加強免疫，同時設置pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS對照。結果表明，該重組質粒誘導產生PCV2抗體水平與其他試驗組相比差異顯著。閆若潛等將豬圓環病毒2型（PCV2）ORF2/豬白介素-2(PoIL-2)嵌合重組表達質粒 (rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日齡健康仔豬，結果發現重組質粒對豬體的免疫和免疫保護效果顯著。

2.5 活載體疫苗

采用弱毒或無毒病原微生物作為表達載體，對其導入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動物，誘導機休產生特異性免疫應答反應，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。Wang等將PCV2 ORF2克隆入 E.coli/L.lac分泌型穿梭表達載體 pSEC: LEISS，構建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap，電轉化乳酸菌NZ9000，獲得能有效表達Cap蛋白的重組乳酸桿菌，將該菌培養液經口灌喂對Balb/c小鼠的生長發育沒有影響，無毒性作用，能夠誘發小鼠產生抗Cap蛋白的特異性IgG抗體，刺激腸道黏膜淋巴組織對其產生黏膜免疫。Kim等將PCV2的ORF2克隆至aroA突變的支氣管炎博德特氏菌獲得表達主要衣殼蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用重組細菌鼻內免疫豬，用PCV2攻毒后，在活BBS-MCP免疫的豬淋巴結中檢測不到PCV2 DNA，結果表明BBS-MCP免疫能有效抵抗PCV2的感染，是發展抗PCV2感染的減毒活疫苗的又一選擇。Ju等用減毒的偽狂犬病病毒(PRV)作為活病毒載體，構建了表達PCV2 ORF1-ORF2的重組病毒PRV-PCV2。試驗表明，PRV-PCV2可誘導小鼠和豬產生強烈的抗PCV2和PRV抗體反應，在小鼠中產生針對PRV的免疫保護，可抵抗致死量的PRV Ea株的攻擊，表明PRV-PCV2可用于抵抗PCV2和PRV感染。Song等將PCV2 ORF2基因插入pIEC-MV質粒，與偽狂犬病毒Tk-/ gE-/LacZ+基因組共轉染IBRS-2細胞，產生一個重組的Tk-/gE-/ORF2(+)病毒。將其免疫4周齡的仔豬檢測其免疫原性。結果表明，該重組病毒能誘導明顯的抗PRV和PCV2體液免疫反應，并且在試驗的第49天能夠檢測到PCV2特異性的淋巴細胞增值反應。Liu等成功構建了融合表達PCV2 ORF2基因與豬IFN-γ基因的重組腺病毒rAd-ORF2-IFN-γ，并證實rAd-ORF2-IFN-γ在小鼠體內誘導產生PCV2特異性抗體的能力比單獨表達Cap蛋白的rAd-ORF2強，表明豬IFN-γ作為細胞因子佐劑可以顯著增強Cap的免疫原性。Pei等在PRRSV cDNA克隆的ORFs1b與2a插入兩個限制性酶切位點及一個轉錄調節序列，將其改造成一個病毒載體，然后將PCV2 ORF2基因插入兩個限制性酶切位點間，由插入的轉錄調節序列啟動轉錄，轉染