食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中LAMP法和分離培養(yǎng)法檢測(cè)沙門(mén)菌屬的比較評(píng)價(jià)

秦玲玲，劉祎婷，袁兵，李琳

齊齊哈爾市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

沙門(mén)菌屬是誘發(fā)細(xì)菌性食物中毒的主要致病因素之一，目前世界已知分離出的血清有二千多種，我國(guó)已知216種血清型。在食品衛(wèi)生檢測(cè)中沙門(mén)菌屬是重要的檢測(cè)項(xiàng)目之一，其致病性得到廣泛關(guān)注，通過(guò)快速準(zhǔn)確的方法檢測(cè)沙門(mén)菌屬對(duì)食品衛(wèi)生安全非常重要。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法能夠較為準(zhǔn)確地檢測(cè)出沙門(mén)菌屬，但是其操作步驟非常繁瑣，耗時(shí)耗力，不能及時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果，免疫學(xué)檢測(cè)方法在對(duì)沙門(mén)菌屬的敏感性較低，參考價(jià)值不理想，PCR法在靈敏度及特異度較好，但是PCR技術(shù)對(duì)于儀器設(shè)備的要求高，一般基層單位不具有檢測(cè)條件，應(yīng)用具有局限性。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種新型的核算擴(kuò)增方法，全名為L(zhǎng)ook-Mediated Isothermal Amplification，通過(guò)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)引導(dǎo)靶基因擴(kuò)增產(chǎn)生DNA混合物，是一種高效，簡(jiǎn)便，檢測(cè)沙門(mén)菌屬特異性高的檢測(cè)方法[1]。該研究于2015年1—6月通過(guò)檢測(cè)153份食品樣品，比較LAMP法和分離培養(yǎng)法檢測(cè)食品中的沙門(mén)菌屬的檢出率，探討其在食品衛(wèi)生實(shí)際檢驗(yàn)中應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究選取2015年1—6月采集的153份食品樣本作為檢驗(yàn)對(duì)象，其中熟肉制品22份，冷凍生肉22份，生鮮肉22份，速凍米面制品22份，豆制品（非發(fā)酵）22份，生鮮水產(chǎn)品15份，鮮榨果汁10份，色拉制品8份，生食類蔬菜5份，冰糕5份，腸炎沙門(mén)菌為陽(yáng)性目標(biāo)控制菌株。

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 食品標(biāo)本前增菌 依據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[2]標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)采集的153份食品樣本進(jìn)行檢驗(yàn)前增菌培養(yǎng)，取各樣本25 g放入到裝有225 mL緩沖蛋白胨水的無(wú)菌均值袋中，在拍打式均質(zhì)器作用下連續(xù)拍擊1～2min，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，冷凍樣品在45℃環(huán)境下解凍15 min。

1.2.2 LAMP法 取食品前增菌各1 mL，在10 000 r/min下，對(duì)前增菌離心2 min，吸出上清液，將核算提取出來(lái)，另取上清液1μL應(yīng)用為DNA待檢模板。通過(guò)文獻(xiàn)[3]對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，檢測(cè)各樣品中的DNA，反應(yīng)體系（25μL）：1.0μL（40μM FIP），1.0μL（40μM BIP），0.5μL（10μM F3）,0.5μL（10μM B3）,2.5μL（Buffer）,3.5μL（10mM dNTP）,5.0μL（5MBetaine）,0.6μL（250 mMMgSO4）,1.0μL（Bst DNA聚合酶），2.0μL（DNA模板），加入ddH2O直至25μL，將反應(yīng)體系混勻放入65℃水浴箱中水浴1 h，然后在80℃下滅活，終止LAMP反應(yīng)。終止反應(yīng)后，通過(guò)肉眼觀察，陽(yáng)性為明顯渾濁，反之為陰性。

1.2.3 分離培養(yǎng)法 依據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)中的方法，分別取1mL均勻震蕩后的各樣品前增菌，移入到10 mL TTB增菌液/10 mL SC增菌液內(nèi)，分別在42℃/37℃下培養(yǎng)22 h，再取增菌液1環(huán)，分別接種到BS平板和XLD平板上，在37℃下培養(yǎng)22 h，選取3個(gè)可疑菌落接種至賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板及TSI上，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)22 h[4]。通過(guò)生化反應(yīng)后，將初步符合沙門(mén)菌特征的可疑菌落從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上取下，加入生理鹽水，制成濁度適中的菌懸液，通過(guò)微生物鑒定儀進(jìn)行分析。若BS平板/XLD平板上均無(wú)可疑菌落，將前者（BS平板）放置在37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)22 h，如沒(méi)有可疑菌落，則可判定沙門(mén)菌為陰性[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采取χ2檢驗(yàn)分析，P＜0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)各樣品陽(yáng)性結(jié)果比較

153份食品樣品中沙門(mén)菌LAMP法檢出22份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為14.38%；分離培養(yǎng)法檢出12份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為7.84%，兩種方法陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種方法對(duì)標(biāo)本樣品沙門(mén)菌陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果情況比較[n(%)]

2.2 兩組陽(yáng)性符合率及陰性符合率

參照分離培養(yǎng)法檢測(cè)，兩組陽(yáng)性符合率為83.33%(10/12)，兩組陰性符合率為91.49%（129/141），陽(yáng)性符合率和陰性符合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社在2000年研發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，作用于靶基因的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4中特異引物，通過(guò)鏈置換DNA聚合酶，在恒定溫度下作用30～60 min達(dá)到擴(kuò)增作用[6]。具有易操作、高特異性的特點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物易被檢測(cè)出來(lái)，通過(guò)渾濁程度肉眼便可判斷沙門(mén)菌是否為陽(yáng)性，檢出率高，廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)中。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法參照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)菌氏檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)，需要對(duì)樣品前增菌、增菌、離心、選出可疑菌落以及生化學(xué)檢查鑒定等，一個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要4 d才可得到陰性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，沙門(mén)菌檢測(cè)結(jié)果需要一周時(shí)間才可得到[7]。操作繁瑣、檢測(cè)步驟較多，需在微生物鑒定系統(tǒng)的支持下對(duì)菌落進(jìn)行分析，同時(shí)涉及到的試劑價(jià)格高，保質(zhì)期較短[8]。相對(duì)于分離培養(yǎng)法，LAMP法只需對(duì)前增菌液提取核酸，展開(kāi)擴(kuò)增試驗(yàn)可在1 h內(nèi)完成擴(kuò)增，檢測(cè)食品樣品中的沙門(mén)菌可在24 h內(nèi)完成，節(jié)省大量人力、物力和時(shí)間，陽(yáng)性結(jié)果可以通過(guò)肉眼觀察判斷，結(jié)果安全可靠，在食品衛(wèi)生檢疫中具有重要意義。

表2 兩種方法檢出沙門(mén)菌陽(yáng)性符合率和陰性符合率情況

該研究通過(guò)LAMP法和分離培養(yǎng)法兩種途徑對(duì)153種食品中沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明LAMP法陽(yáng)性檢出率（14.38%）高于分離培養(yǎng)法（7.84%），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組陽(yáng)性符合率及陰性符合率比較中，以分離培養(yǎng)法作為參照，陽(yáng)性符合率（83.33%）和陰性符合率（91.49%）均較高，無(wú)顯著差異。

LAMP法是對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行核酸檢測(cè)，具有快捷、方便、陽(yáng)性檢出率高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是不能分離菌株和鑒定分型，在實(shí)際檢測(cè)工作中可以將LAMP法與分離培養(yǎng)法相結(jié)合，通過(guò)LAMP法確定陽(yáng)性結(jié)果，分離培養(yǎng)法對(duì)菌落進(jìn)行菌株分離和鑒定分型，提高工作效率。

[1]姜彥君，都啟晶，趙宏坤.食源性致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013(10)：162-169.

[2]章偉帆.沙門(mén)菌快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].臺(tái)灣農(nóng)業(yè)探索，2013，35(4):66-70.

[3]袁發(fā)滸，尹歡，李琦，等.腸炎沙門(mén)菌的LAMP檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)釀造，2013，32(4)：146-149.

[4]周青華.南丹縣沙門(mén)菌食物中毒調(diào)查及防治對(duì)策[J].中國(guó)農(nóng)村衛(wèi)生，2013,5(12)：319-320.

[5]諸葛石養(yǎng)，韋程媛，李秀桂.廣西食源性與禽源性沙門(mén)菌血清型分布及耐藥性研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2013，13(9):1061-1063.

[6]王帆,周石.肝動(dòng)脈化療栓塞聯(lián)合氬氦刀治療原發(fā)性肝癌療效評(píng)價(jià)[J].介入放射學(xué)雜志,2005,14（6）:637-639.

[7]于慶華.沙門(mén)菌屬感染的診療[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘：電子版，2013，13(14):89，92.

[8]葉文，楊柳青，張如勝，等.沙門(mén)菌屬LAMP檢測(cè)力法在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中華疾病控制雜志，2011，15(9):785-787.