食品衛生檢驗中LAMP法和分離培養法檢測沙門菌屬的比較評價

秦玲玲，劉祎婷，袁兵，李琳

齊齊哈爾市疾病預防控制中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

沙門菌屬是誘發細菌性食物中毒的主要致病因素之一，目前世界已知分離出的血清有二千多種，我國已知216種血清型。在食品衛生檢測中沙門菌屬是重要的檢測項目之一，其致病性得到廣泛關注，通過快速準確的方法檢測沙門菌屬對食品衛生安全非常重要。傳統的分離培養法能夠較為準確地檢測出沙門菌屬，但是其操作步驟非常繁瑣，耗時耗力，不能及時得到檢測結果，免疫學檢測方法在對沙門菌屬的敏感性較低，參考價值不理想，PCR法在靈敏度及特異度較好，但是PCR技術對于儀器設備的要求高，一般基層單位不具有檢測條件，應用具有局限性。

環介導等溫擴增法（LAMP）是一種新型的核算擴增方法，全名為Look-Mediated Isothermal Amplification，通過等溫核酸擴增技術引導靶基因擴增產生DNA混合物，是一種高效，簡便，檢測沙門菌屬特異性高的檢測方法[1]。該研究于2015年1—6月通過檢測153份食品樣品，比較LAMP法和分離培養法檢測食品中的沙門菌屬的檢出率，探討其在食品衛生實際檢驗中應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究選取2015年1—6月采集的153份食品樣本作為檢驗對象，其中熟肉制品22份，冷凍生肉22份，生鮮肉22份，速凍米面制品22份，豆制品（非發酵）22份，生鮮水產品15份，鮮榨果汁10份，色拉制品8份，生食類蔬菜5份，冰糕5份，腸炎沙門菌為陽性目標控制菌株。

1.2 檢驗方法

1.2.1 食品標本前增菌 依據《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[2]標準，對采集的153份食品樣本進行檢驗前增菌培養，取各樣本25 g放入到裝有225 mL緩沖蛋白胨水的無菌均值袋中，在拍打式均質器作用下連續拍擊1～2min，在37℃培養箱中培養12 h，冷凍樣品在45℃環境下解凍15 min。

1.2.2 LAMP法 取食品前增菌各1 mL，在10 000 r/min下，對前增菌離心2 min，吸出上清液，將核算提取出來，另取上清液1μL應用為DNA待檢模板。通過文獻[3]對引物進行設計，檢測各樣品中的DNA，反應體系（25μL）：1.0μL（40μM FIP），1.0μL（40μM BIP），0.5μL（10μM F3）,0.5μL（10μM B3）,2.5μL（Buffer）,3.5μL（10mM dNTP）,5.0μL（5MBetaine）,0.6μL（250 mMMgSO4）,1.0μL（Bst DNA聚合酶），2.0μL（DNA模板），加入ddH2O直至25μL，將反應體系混勻放入65℃水浴箱中水浴1 h，然后在80℃下滅活，終止LAMP反應。終止反應后，通過肉眼觀察，陽性為明顯渾濁，反之為陰性。

1.2.3 分離培養法 依據《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》標準中的方法，分別取1mL均勻震蕩后的各樣品前增菌，移入到10 mL TTB增菌液/10 mL SC增菌液內，分別在42℃/37℃下培養22 h，再取增菌液1環，分別接種到BS平板和XLD平板上，在37℃下培養22 h，選取3個可疑菌落接種至賴氨酸脫羧酶試驗培養基、營養瓊脂平板及TSI上，在37℃下繼續培養22 h[4]。通過生化反應后，將初步符合沙門菌特征的可疑菌落從營養瓊脂平板上取下，加入生理鹽水，制成濁度適中的菌懸液，通過微生物鑒定儀進行分析。若BS平板/XLD平板上均無可疑菌落，將前者（BS平板）放置在37℃恒溫箱中繼續培養22 h，如沒有可疑菌落，則可判定沙門菌為陰性[5]。

1.3 統計方法

采用SPSS 18.0對數據分析，計數資料用率（%）表示，采取χ2檢驗分析，P＜0.05說明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測各樣品陽性結果比較

153份食品樣品中沙門菌LAMP法檢出22份陽性樣品，陽性率為14.38%；分離培養法檢出12份陽性樣品，陽性率為7.84%，兩種方法陽性檢出率比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩種方法對標本樣品沙門菌陽性檢測結果情況比較[n(%)]

2.2 兩組陽性符合率及陰性符合率

參照分離培養法檢測，兩組陽性符合率為83.33%(10/12)，兩組陰性符合率為91.49%（129/141），陽性符合率和陰性符合率比較差異無統計學意義（P﹥0.05），見表2。

3 討論

環介導等溫擴增法（LAMP）是日本榮研化學株式會社在2000年研發的一種新型核酸擴增技術，作用于靶基因的6個區域，設計4中特異引物，通過鏈置換DNA聚合酶，在恒定溫度下作用30～60 min達到擴增作用[6]。具有易操作、高特異性的特點，擴增產物易被檢測出來，通過渾濁程度肉眼便可判斷沙門菌是否為陽性，檢出率高，廣泛應用于食品微生物檢測中。傳統的分離培養法參照《食品微生物學檢驗沙門菌氏檢驗》標準，需要對樣品前增菌、增菌、離心、選出可疑菌落以及生化學檢查鑒定等，一個檢測過程需要4 d才可得到陰性檢驗數據，沙門菌檢測結果需要一周時間才可得到[7]。操作繁瑣、檢測步驟較多，需在微生物鑒定系統的支持下對菌落進行分析，同時涉及到的試劑價格高，保質期較短[8]。相對于分離培養法，LAMP法只需對前增菌液提取核酸，展開擴增試驗可在1 h內完成擴增，檢測食品樣品中的沙門菌可在24 h內完成，節省大量人力、物力和時間，陽性結果可以通過肉眼觀察判斷，結果安全可靠，在食品衛生檢疫中具有重要意義。

表2 兩種方法檢出沙門菌陽性符合率和陰性符合率情況

該研究通過LAMP法和分離培養法兩種途徑對153種食品中沙門菌進行檢測，結果表明LAMP法陽性檢出率（14.38%）高于分離培養法（7.84%），具有統計學意義（P＜0.05）；兩組陽性符合率及陰性符合率比較中，以分離培養法作為參照，陽性符合率（83.33%）和陰性符合率（91.49%）均較高，無顯著差異。

LAMP法是對沙門菌進行核酸檢測，具有快捷、方便、陽性檢出率高、結果準確等優點，但是不能分離菌株和鑒定分型，在實際檢測工作中可以將LAMP法與分離培養法相結合，通過LAMP法確定陽性結果，分離培養法對菌落進行菌株分離和鑒定分型，提高工作效率。

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