脊髓缺血再灌注損傷對兔脊髓微循環(huán)的影響*

方 華，章建平#，章放香，張競超，王泉云，王儒蓉,劉 進(jìn)

1)貴陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科 貴陽 550002 2)四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科 成都 610041

脊髓缺血再灌注損傷對兔脊髓微循環(huán)的影響*

方 華1)，章建平1)#，章放香1)，張競超1)，王泉云2)，王儒蓉2),劉 進(jìn)2)

1)貴陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科 貴陽 550002 2)四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科 成都 610041

#通信作者，女，1979年6月生，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉學(xué)，E-mail:zhangjianping666@126.com

脊髓；缺血再灌注；微循環(huán)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；兔

目的：探討脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)對脊髓微循環(huán)的影響。方法：采用腎下腹主動(dòng)脈阻斷模型,分別阻斷兔腹主動(dòng)脈30(C30組)、45(C45組)和60 min(C60組)后再灌注, 假手術(shù)組(C0組)不阻斷血流。于缺血前、缺血期間、再灌注期間監(jiān)測脊髓微循環(huán)血流速度和微循環(huán)血流量(SCMBF)，再灌注120 min后觀察脊髓組織中丙二醛(MDA)含量，誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、髓過氧化物酶(MPO)、活性氧(ROS)活力，核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65 (NF-κBp65)、抑制蛋白-κBα(I-κBα)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白的表達(dá)及脊髓病理學(xué)變化。結(jié)果：C30、C45、C60組脊髓組織分別表現(xiàn)為輕、中、重度SCIRI病理學(xué)改變。缺血再灌注期間，4組脊髓微循環(huán)血流速度和SCMBF的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=12.051和54.514，F(xiàn)時(shí)間=66.084和171.028，F(xiàn)交互=12.032和35.752，P均<0.05)；C45、C60組再灌注120 min時(shí)SCMBF仍未恢復(fù)至術(shù)前水平(P<0.05)。再灌注120 min 時(shí)，C0、C30、C45、C60組脊髓組織中MDA含量和iNOS、MPO、ROS活力依次增高(P<0.05)，NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達(dá)依次增強(qiáng)(P<0.05)，I-κBα表達(dá)依次降低(P<0.05)。結(jié)論：脊髓微循環(huán)狀態(tài)能夠敏感而準(zhǔn)確地反映SCIRI程度, ICAM-1和NF-κBp65表達(dá)上調(diào)加重脊髓微循環(huán)障礙。

微循環(huán)障礙是脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCIRI)中重要的病理生理學(xué)特征[1-2]。脊髓神經(jīng)功能的維持依賴于微循環(huán)結(jié)構(gòu)的完整，脊髓微循環(huán)障礙將嚴(yán)重影響SCIRI術(shù)后神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-6]。微循環(huán)障礙的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)等炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，而核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65(nuclear factor-kappa Bp65，NF-κBp65)和抑制蛋白-κBα(inhibitor-kappa Bα，I-κBα)的相互作用在調(diào)控炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起重要作用[3-6]。作者比較了不同程度SCIRI模型兔脊髓微循環(huán)血流量(spinal cord microcirculatory blood flow，SCMBF)和血流速度的變化規(guī)律，同時(shí)觀察了脊髓組織中ICAM-1、NF-κBp65和 I-κBα表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠抗兔ICAM-1、I-κBα及 NF-κBp65 多克隆抗體均為Sigma公司產(chǎn)品；SABC檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)活力檢測試劑盒、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活力檢測試劑盒及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活力檢測試劑盒均為中國上海研吉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 4～6月齡健康純種新西蘭大耳白兔40只，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重2.0～2.5 kg，雌雄不拘，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(C0組)、C30、C45和C60組，每組10只。采用左腎動(dòng)脈下方腹主動(dòng)脈阻斷法建立SCIRI動(dòng)物模型[7]：耳緣靜脈注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔后，無菌條件下取腹正中切口,仔細(xì)分離并顯露左腎動(dòng)脈及腹主動(dòng)脈,于左腎動(dòng)脈起始點(diǎn)下方約0.5 cm處，用中號動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉腹主動(dòng)脈，夾閉前經(jīng)耳緣靜脈注射肝素1 mg/kg。證實(shí)鉗夾點(diǎn)以下腹主動(dòng)脈搏動(dòng)完全消失后,C30、C45、C60組分別在阻斷30、45和60 min后取消夾閉，開放腹主動(dòng)脈行再灌注，時(shí)間均為120 min。C0組不阻斷腹主動(dòng)脈，其他操作同上。左腹股溝區(qū)備皮，消毒鋪巾后股動(dòng)脈插管監(jiān)測血壓并抽取血?dú)狻Ｐg(shù)中以生理鹽水浸潤的溫紗墊覆蓋腹腔臟器，肛門溫度維持在36～37 ℃。術(shù)中監(jiān)測心電圖(ECG)、動(dòng)脈血?dú)狻⒔?jīng)皮脈搏氧飽和度、平均動(dòng)脈壓及肛門溫度。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 脊髓微循環(huán)血流速度和SCMBF的測量 選用Peri Flux System 5001型多通道系統(tǒng)激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)測定缺血前、缺血1 min、缺血5 min、再灌注15 min、再灌注30 min、再灌注60 min和再灌注120 min時(shí)L3/4段的SCMBF：無菌條件下取背部正中切口，逐層切開背部皮膚、皮下及肌肉組織，充分暴露L3/4段腰椎間隙，用細(xì)嘴咬骨鉗咬去雙側(cè)椎板，顯露L3/4段脊髓。將無菌激光掃描探頭與暴露的脊髓面成90°角貼于L3/4硬脊膜上，以獲取脊髓微循環(huán)血流信號[8]；將標(biāo)準(zhǔn)光纖探頭置于腰椎旁肌表面作為對照。血流速度單位為VU(velocity unit)，SCMBF的單位為PU(perfusion unit)。C0組在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測定血流速度和SCMBF。

1.3.2 脊髓組織病理學(xué)觀察及ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65蛋白的檢測 各組分別于再灌注120 min后取L3/4節(jié)段脊髓組織,于福爾馬林中固定。取一部分脊髓組織常規(guī)HE染色后，采用OlympusBX51圖像采集分析系統(tǒng)等距隨機(jī)抽樣法觀察脊髓組織病理學(xué)表現(xiàn)。另取一部分脊髓組織，采用免疫組化SABC法測定脊髓組織中ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65的表達(dá)。參照文獻(xiàn)[9]，使用OlympusBX51圖像采集分析系統(tǒng)等距隨機(jī)抽樣攝片并定量分析各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65細(xì)胞核陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和胞核平均灰度值。

1.3.3 脊髓組織中MDA含量和iNOS、MPO及ROS活力檢測 各組分別于再灌注120 min后取L3/4節(jié)段脊髓組織,加入4 ℃生理鹽水超聲勻漿，3 500 r/min離心5 min后取上清液置于-80 ℃冰箱凍存，采用硫代巴比妥酸法測定脊髓組織中MDA含量，采用Fenton自由基反應(yīng)法測定iNOS活力，采用過氧化氫還原法測定MPO活力，采用催化L-Arg氧反應(yīng)法測定ROS活力，均按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間血流速度和SCMBF的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間MDA含量，iNOS、MPO、ROS活力和目的蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況 手術(shù)結(jié)束2 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均完全清醒。實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物均無意外死亡。

2.2 4組血流速度和SCMBF的比較 見表1、2。C0組血流速度和SCMBF均無明顯變化。缺血后各損傷組血流速度和SCMBF均較缺血前迅速下降，缺血5 min時(shí)血流波形消失。C30組再灌注15和30 min時(shí)血流速度和SCMBF均高于缺血前，再灌注60和120 min時(shí)則明顯下降至缺血前水平。C45、C60組再灌注15和30 min時(shí)血流速度和SCMBF均高于缺血前和同期C30組水平，再灌注60和120 min時(shí)血流速度和SCMBF均明顯低于缺血前和同期C30組水平，C60組變化較C45組更顯著。

表1 4組脊髓血流速度的比較 VU

F組間=12.051，F(xiàn)時(shí)間=66.084，F(xiàn)交互=12.032，P均<0.001；*:與缺血前比較，P<0.01;#:與C30組比較，P<0.01;▲:與C45組比較,P<0.01。

表2 4組脊髓SCMBF的比較 PU

F組間=54.514，F(xiàn)時(shí)間=171.028，F(xiàn)交互=35.752，P均<0.001；*:與缺血前比較，P<0.01;#:與C30組比較，P<0.01;▲:與C45組比較,P<0.01。

2.3 4組脊髓組織病理學(xué)表現(xiàn) C0組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，無出血、水腫等病理學(xué)表現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元輪廓清晰(圖1A)。C30組脊髓組織中可見出血灶，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元輕度腫脹，周圍間隙增加，部分核仁不清(圖1B)。C45組脊髓組織內(nèi)出血灶明顯，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元顯著腫脹，周圍間隙明顯增加，核仁不清，少量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元空泡形成或變性壞死(圖1C)。C60組脊髓組織內(nèi)可見大片狀出血灶，大量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性壞死及廣泛空泡形成(圖1D)。

圖1 脊髓病理學(xué)表現(xiàn)(HE， ×400)

2.4 4組脊髓組織中NF-κBp65、I-κBα和ICAM-1表達(dá)水平的比較 見表3。C0、C30、C45、C60組脊髓組織中NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達(dá)依次增強(qiáng)，I-κBα表達(dá)則依次減弱。

2.5 4組脊髓組織中MDA含量及iNOS、MPO、ROS活力的比較 見表4。再灌注120 min時(shí),C0、C30、C45、C60組MDA含量和iNOS、MPO、ROS活力依次增高。

表3 4組脊髓組織中NF-κBp65、I-κBα和ICAM-1表達(dá)的比較

*:與C0組比較,P<0.01;#：與C30組比較,P<0.01;▲：與C45組比較,P<0.01。

表4 4組脊髓組織中iNOS、ROS、MPO活力及MDA含量的比較

*:與C0組比較,P<0.01;#：與C30組比較，P<0.01;▲：與C45組比較,P<0.01。

3 討論

脊髓神經(jīng)功能的維持依賴于微循環(huán)結(jié)構(gòu)的完整，SCIRI期間脊髓微循環(huán)障礙將嚴(yán)重影響術(shù)后神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-6]。該實(shí)驗(yàn)中，麻醉藥物戊巴比妥鈉對SCMBF無明顯影響[9]，而阻斷腹主動(dòng)脈血流1 min后脊髓微循環(huán)血流速度和SCMBF較缺血前明顯降低，阻斷腹主動(dòng)脈5min時(shí)微循環(huán)灌注波形完全消失，提示阻斷水平以下脊髓血液循環(huán)完全被阻斷，說明血流速度和SCMBF可靈敏反映脊髓微循環(huán)狀態(tài)。為不影響術(shù)中完整的脊髓微循環(huán)監(jiān)測，監(jiān)測過程中未采集脊髓組織進(jìn)行病理學(xué)觀察及生化指標(biāo)檢測。

該研究中在灌注120 min后，C30組表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元輕度腫脹及周圍間隙增加等輕度SCIRI病理學(xué)改變，C45組表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯腫脹及核固縮等中度SCIRI病理學(xué)改變，C60組表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元廣泛性溶解及壞死等重度SCIRI病理學(xué)改變，說明腹主動(dòng)脈血流阻斷30、45及60 min后再灌注可分別引起輕、中和重度SCIRI。輕度SCIRI(C30組)再灌注60 min后脊髓微循環(huán)能夠恢復(fù)至缺血前水平，提示輕度SCIRI中微循環(huán)障礙具有可逆性，微循環(huán)功能可以自行恢復(fù)，術(shù)后脊髓神經(jīng)功能可能恢復(fù)較好；中、重度SCIRI(C45和C60組)再灌注15和30 min后脊髓微循環(huán)表現(xiàn)為病理性高灌流狀態(tài)，再灌注60 min后脊髓微循環(huán)表現(xiàn)為延遲性低灌流狀態(tài)，且中、重度SCIRI中脊髓微循環(huán)功能變化存在明顯差異，中度SCIRI(C45組)再灌注60 min后血流速度和SCMBF均顯著高于重度SCIRI(C60組)，提示中度SCIRI中微循環(huán)功能僅僅部分恢復(fù)，而重度SCIRI中微循環(huán)功能與結(jié)構(gòu)的完整性受到不可逆破壞。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在著NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，靜息狀態(tài)下NF-κBp65與I-κBα以同源或異源二聚體非活性形式錨定于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，只有I-κBα磷酸化后NF-κBp65/I-κBα二聚體解離，NF-κBp65才具備活性[10-11]。該研究發(fā)現(xiàn)，輕、中和重度SCIRI再灌注120 min后脊髓組織中I-κBα蛋白表達(dá)逐漸降低，而NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達(dá)逐漸升高，提示SCIRI時(shí)脊髓組織中NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)，調(diào)控ICAM-1表達(dá)上調(diào)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。ROS和iNOS可通過直接誘導(dǎo)I-κBα蛋白水解磷酸化啟動(dòng)NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[12-13]。MDA、ROS及MPO是中性粒細(xì)胞活化過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的炎癥因子[14-16]。iNOS可通過NO自由基與超氧自由基反應(yīng)生成超氧亞硝基陰離子ONOO-而損傷細(xì)胞[17-18]。該研究結(jié)果表明，中、重度SCIRI脊髓微循環(huán)障礙時(shí)脊髓組織中NF-κBp65及ICAM-1蛋白表達(dá)升高的同時(shí)，MDA含量和MPO、iNOS、ROS活力也顯著增強(qiáng)，提示在脊髓微循環(huán)障礙狀態(tài)下MDA、iNOS、MPO及ROS等炎癥介質(zhì)可能通過NF-κBp65/I-κBα途徑引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重SCIRI。

[1]Thorfinn J,Sj?berg F,Lidman D.Perfusion of buttock skin in healthy volunteers after long and short repetitive loading evaluated by laser Doppler perfusion imager[J].Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg,2007,41(6):297

[2]Huang L,Lin X,Tang Y,et al.Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion[J].Spinal Cord,2013,51(3):196

[3]Kubota K,Saiwai H,Kumamaru H,et al.Neurological recovery is impaired by concurrent but not by asymptomatic pre-existing spinal cord compression after traumatic spinal cord injury[J].Spine(Phila Pa 1976),2012,37(17):1448

[4]Jan YK,Liao F,Jones MA,et al.Effect of durations of wheelchair tilt-in-space and recline on skin perfusion over the ischial tuberosity in people with spinal cord injury[J].Arch Phys Med Rehabil,2013,94(4):667

[5]Phillips JP,Cibert-Goton V,Langford RM,et al.Perfusion assessment in rat spinal cord tissue using photoplethysmography and laser Doppler flux measurements[J].J Biomed Opt,2013,18(3):037005

[6]Liang CL,Lu K,Liliang PC,et al.Ischemic preconditioning ameliorates spinal cord ischemia-reperfusion injury by triggering autoregulation[J].J Vasc Surg,2012,55(4):1116

[7]Simon F,Scheuerle A,Calzia E,et al.Erythropoietin during porcine aortic balloon occlusion-induced ischemia/reperfusion injury[J].Crit Care Med,2008,36(7):2143

[8]Blaser A,Lang J,Henke D,et al.Influence of durotomy on laser-Doppler measurement of spinal cord blood flow in chondrodystrophic dogs with thoracolumbar disk extrusion[J].Vet Surg,2012,41(2):221

[9]成令忠,鐘翠平,蔡文琴.現(xiàn)代組織學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2003:38

[10]Zhou C,Shi X,Huang H,et al.Montelukast attenuates neuropathic pain through inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappa B in a rat model of chronic constriction injury[J].Anesth Analg,2014,118(5):1090

[11]Xu YQ,Jin SJ,Liu N,et al.Aloperine attenuated neuropathic pain induced by chronic constriction injury via anti-oxidation activity and suppression of the nuclear factor kappa B pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,451(4):568

[12]Liou CJ,Len WB,Wu SJ,et al.Casticin inhibits COX-2 and iNOS expression via suppression of NF-κB and MAPK signaling in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages[J].J Ethnopharmacol,2014,158(Pt A):310

[13]Koriyama Y,Nakayama Y,Matsugo S,et al.Anti-inflammatory effects of lipoic acid through inhibition of GSK-3β in lipopolysaccharide-induced BV-2 microglial cells[J].Neurosci Res,2013,77(1/2):87

[14]Tavuk?u HH,Sener TE,Tinay I,et al.Melatonin and tadalafil treatment improves erectile dysfunction after spinal cord injury in rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2014,41(4):309

[15]Wang Y,Su R,Lv G,et al.Supplement zinc as an effective treatment for spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats[J].Brain Res,2014,1545:45

[16]Senturk S,Gurcay AG,Bozkurt I,et al.Effects of tadalafil-Type-V phosphodiesterase enzyme inhibitor-On rats with spinal trauma[J].Br J Neurosurg,2014,7(3):1

[17]Chou AK,Yang MC,Tsai HP,et al.Adenoviral-mediated glial cell line-derived neurotrophic factor gene transfer has a protective effect on sciatic nerve following constriction-induced spinal cord injury[J].PLoS One,2014,9(3):e92264

[18]Zirak MR,Rahimian R,Ghazi-Khansari M,et al.Tropisetron attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J].Eur J Pharmacol,2014,738(38):222

(2014-11-25 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury on rabbit spinal cord microcirculatory

FANGHua1),ZHANGJianping1),ZHANGFangxiang1),ZHANGJingchao1),WANGQuanyun2),WANGRurong2),LIUJin2)

1)DepartmentofAnesthesiology,theAffiliatedPeople’sHospital,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550002 2)DepartmentofAnesthesiology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041

spinal cord；ischemia-reperfusion；microcirculatory；NF-κB;rabbit

Aim: To investigate the effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury(SCIRI) on spinal cord microcirculatory.Methods: The kidney ventral aorta block model was established and the rabbit abdominal aorta were blocked for 0(C0 group), 30(C30 group), 45(C45 group) and 60(C60 group) min, respectively.During ischemia and reperfusion, velocity and microcirculation blood flow(SCMBF) were monitored. After 120 min reperfusion, the pathological observation of spinal cord tissue was performed, and malondialdehyde(MDA) content, the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS), myeloperoxidase(MPO), reactive oxygen species(ROS), nuclear factors-kappa Bp65 (NF-κBp65), inhibitor-kappa Bα(I-κBα) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) protein expression were detected. Results: The C30, C45, C60 group performanced mild, medium and heavy SCIRI pathological manifestations. During the period of ischemia and reperfusion, the differences in changes of the velocity and SCMBF among the four groups were statistically significant (Fgroup=12.051 and 54.514,Ftime=66.084 and 171.028,Finteraction=12.032 and 35.752,P<0.05); SCMBF of C45, C60 groups still had not returned to preoperative levels after 120 min reperfusion(P<0.05). After 120 min reperfusion, MDA content and the activity of iNOS, MPO and ROS in C0, C30, C45, and C60 groups increased in turn(P<0.05), the NF-κBp65 and ICAM-1 expression increased in turn(P<0.05), and I-κBα expression reduced(P<0.05). Conclusion: Spinal cord microcirculation monitoring can sensitively and accurately reflect the degree of SCIRI. The upregulation of the expressions of ICAM-1 and NF-κBp65 might aggravate the spinal cord SCIRI during microcirculatory dysfunction.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.007

*貴州省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目 gzwkj2010-1-006，gzwkj2012-1-015；貴州省科技廳基金項(xiàng)目 黔科合SY字[2011]008號，黔科SY字[2012]3090號

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