轉(zhuǎn)染TDP-25對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力、凋亡的影響*

周玉帥，殷競(jìng)爭(zhēng)，張瑞鋒，滕軍放#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

轉(zhuǎn)染TDP-25對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力、凋亡的影響*

周玉帥1,2)，殷競(jìng)爭(zhēng)1,2)，張瑞鋒1,2)，滕軍放1,2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

TDP-25；自噬；細(xì)胞活力；細(xì)胞凋亡

目的：探討TDP-25對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力、凋亡的影響。方法：將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y分為3組，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25，24 h后應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)包涵體，Western blot法檢測(cè)LC3、 Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。將SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-TDP-25后分為2組，一組加自噬抑制劑3-MA,一組不加3-MA,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：GFP-N1組細(xì)胞胞質(zhì)、胞核均見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光信號(hào)；GFP-TDP-43組較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)分布于胞核中，未見(jiàn)明顯的包涵體形成；GFP-TDP-25組可見(jiàn)較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)顆粒狀分布于胞質(zhì)中，形成包涵體；3組Beclin-1表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=192.700、247.420，P<0.05)，GFP-TDP-25組Beclin-1表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43組(P<0.05)，后者大于GFP-N1組(P<0.05)。加入3-MA后，轉(zhuǎn)染GFP-TDP-25的細(xì)胞細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增高(t=38.595、5.920，P<0.001)。結(jié)論：TDP-25可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞巨自噬水平減弱其對(duì)細(xì)胞的損害。調(diào)控巨自噬水平對(duì)肌萎縮性側(cè)索硬化癥和額顳葉變性患者的病情進(jìn)展可能起到一定的延緩作用。

TDP-43(transactive response DNA-binding protein of 43 000)是一種DNA和RNA結(jié)合蛋白，在心臟、腎臟、肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[1]，結(jié)構(gòu)上含有兩個(gè)RNA識(shí)別基序，N端區(qū)域具有核定位信號(hào)(NLS)和核輸出信號(hào)(NES)，同時(shí)N端區(qū)域還具有3個(gè)Caspase-3水解位點(diǎn)(TDP-43可被水解形成截短型片段)，C末端區(qū)域富含甘氨酸序列，介導(dǎo)蛋白間的相互作用[2]。生理狀態(tài)下TDP-43主要定位于胞核，通過(guò)與DNA和RNA結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄、剪切等過(guò)程，也參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂和神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)等過(guò)程[3]。病理狀態(tài)下，移位至胞質(zhì)的TDP-43被過(guò)磷酸化、泛素化和水解生成保留C末端的截短型片段(TDP-35和TDP-25)，可溶性降低并形成聚集物，喪失功能。Neumann等[4]研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration，F(xiàn)TLD)患者腦組織中存在TDP-43陽(yáng)性包涵體，其主要成分為過(guò)磷酸化、泛素化TDP-43和TDP-35、TDP-25。自噬(autophagy)作為細(xì)胞降解受損細(xì)胞器和異常蛋白的途徑之一，是否參與TDP-43陽(yáng)性包涵體的形成，TDP-25是否參與ALS和FTLD的致病過(guò)程至今仍不清楚。作者構(gòu)建了過(guò)表達(dá)TDP-25的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y模型，觀察模型細(xì)胞包涵體形成情況、細(xì)胞活力和凋亡的變化、自噬蛋白LC3和 Beclin-1的表達(dá)情況，探討TDP-25與自噬的關(guān)系，初步探討ALS和FTLD可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SH-SY5Y細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院唐北沙教授饋贈(zèng)；質(zhì)粒GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25由課題組構(gòu)建；DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Beclin-1、LC3一抗均購(gòu)自Abcam公司，GAPDH購(gòu)自Santa Cruz公司；過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Promega公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞中包涵體的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，以1.5 mL/孔接種于12孔板，隨機(jī)分為3組，24 h后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25，轉(zhuǎn)染24 h后每孔用40 g/L多聚甲醛固定10 min，1×PBS漂洗3遍后，應(yīng)用熒光顯微鏡(Olympus DP71)在320倍視野下觀察，分析熒光情況，抽取10個(gè)不相重復(fù)的視野拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞活力的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，以0.1 mL/孔接種于96孔板，隨機(jī)分為2組，每組16個(gè)復(fù)孔，24 h后轉(zhuǎn)染GFP-TDP-25，轉(zhuǎn)染12 h后一組每孔給予10 mmol/L 3-MA處理(GFP-TDP-25+3-MA組)，另一組不予處理(GFP-TDP-25組)。轉(zhuǎn)染24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μL二甲基亞砜，選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，表示細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，以2 mL/孔接種于6孔板，隨機(jī)分為2組，分組處理方法同1.5。轉(zhuǎn)染 24 h 后細(xì)胞均用0.14 g/L EDTA消化，調(diào)整每組細(xì)胞密度為5×105mL-1，各取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL 20 g/L PI溶液，孵育15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex=488 nm，Em=530 nm)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25組細(xì)胞LC3、Beclin-1表達(dá)情況的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細(xì)胞活力、凋亡率的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 包涵體檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖 1。GFP-N1組細(xì)胞胞質(zhì)、胞核均見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光信號(hào)；GFP-TDP-43組較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)分布于胞核中，未見(jiàn)明顯的包涵體形成；GFP-TDP-25組可見(jiàn)較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)顆粒狀分布于胞質(zhì)中，形成包涵體。

2.2 GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25組細(xì)胞中LC3、 Beclin-1蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)圖2、表1。GFP-TDP-25組Beclin-1/GAPDH及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43組，后者大于GFP-N1組。

組別nLC3-Ⅱ/LC3-ⅠBeclin-1/GAPDHGFP-N1組360.051±0.0090.010±0.005GFP-TDP-43組360.135±0.045*0.016±0.002*GFP-TDP-25組360.326±0.095*#0.040±0.009*#F192.700247.720P<0.001<0.001

*：與GFP-N1組比較，P<0.05；#：與GFP-TDP-43組比較，P<0.05。

2.3 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細(xì)胞活力、凋亡率的比較 見(jiàn)表2。

表2 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細(xì)胞活力、凋亡率的比較

與GFP-TDP-25組比較，GFP-TDP-25+3-MA組細(xì)胞活力降低，而細(xì)胞凋亡率增高。

3 討論

ALS是一種致命的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無(wú)力、肌萎縮等，該病無(wú)法治愈，患者最終因呼吸衰竭而死亡，從發(fā)現(xiàn)臨床癥狀開(kāi)始，平均生存期為2～4 a[5-6]。在65歲以下的人群中FTLD是第二大常見(jiàn)的癡呆性疾病[7]，其臨床表現(xiàn)為行為異常、言語(yǔ)障礙和運(yùn)動(dòng)障礙等[8]，絕大多數(shù)患者發(fā)病年齡在45～65歲，病程2～20 a，平均約8 a，目前無(wú)有效的治療方案[9]。其臨床癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)的病理特點(diǎn)與ALS有一定重疊性，說(shuō)明ALS和FTLD可能是同一種神經(jīng)退行性疾病，只是易感神經(jīng)元不同[10]。Neumann等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ALS和FTLD患者神經(jīng)組織中存在TDP-43陽(yáng)性包涵體，TDP-25為其主要成分，TDP-25的產(chǎn)生機(jī)制可能與Caspase-3有關(guān)。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)抑制顆粒蛋白前體基因(PGRN)表達(dá)后Caspase-3被激活，TDP-43被水解形成TDP-25。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源性TDP-43并未在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中形成包涵體，TDP-43定位于胞核；而轉(zhuǎn)染TDP-25的細(xì)胞形成包涵體，TDP-25分布于胞質(zhì)；說(shuō)明TDP-25與包涵體的形成有關(guān)。Winton等[12]研究發(fā)現(xiàn)TDP-25缺乏NLS，因此無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核而聚集于胞質(zhì)內(nèi)。有研究[2]發(fā)現(xiàn)TDP-25被磷酸化后水溶性降低且具有細(xì)胞毒性。Caccamo等[13]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TDP-25可誘導(dǎo)內(nèi)源性TDP-43于胞質(zhì)中聚集，隨之胞核中的TDP-43水平降低。因此推測(cè)包涵體的形成與TDP-25本身易聚集等特點(diǎn)和其對(duì)TDP-43的作用有關(guān)。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同分為3類(lèi)：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone -mediated autophagy，CMA)。通常說(shuō)的自噬是指巨自噬[14-15]。自噬是一種可誘導(dǎo)的過(guò)程，病理學(xué)損傷和蛋白異常聚集均可上調(diào)自噬水平，自噬通過(guò)降解異常聚集、錯(cuò)誤折疊的蛋白和受損的細(xì)胞器等來(lái)減輕細(xì)胞損害，從而起到保護(hù)作用。然而過(guò)度的自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡[16]。LC3、Beclin-1作為巨自噬的分子標(biāo)記物，已成為檢測(cè)巨自噬活性的重要方法。Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，說(shuō)明巨自噬水平上調(diào)，反之說(shuō)明巨自噬水平下調(diào)[17-19]。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GFP-TDP-25組細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于GFP-TDP-43組和GFP-N1組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)TDP-25誘導(dǎo)了細(xì)胞巨自噬水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與GFP-TDP-25組比較，加入自噬抑制劑 3-MA的GFP-TDP-25+3-MA組細(xì)胞凋亡率較增加，細(xì)胞活力減弱,說(shuō)明TDP-25可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞巨自噬水平減弱其對(duì)細(xì)胞的損害。有研究[13,20]發(fā)現(xiàn)自噬參與降解異常的TDP-43、TDP-25，抑制自噬后TDP-25的聚集增加，誘導(dǎo)自噬后可降低TDP-25的聚集和恢復(fù)TDP-43的核定位。因此推測(cè)，作為一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，上調(diào)巨自噬可能加速清除TDP-43陽(yáng)性包涵體，從而減輕TDP-25誘導(dǎo)的細(xì)胞損害，對(duì)ALS和FTLD患者病情進(jìn)展可能起到一定的延緩作用。

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(2014-10-27 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of autophagy proteins and cell vitality,apoptosis of SH-SY5Y cells transfected with TDP-25

ZHOUYushuai1,2)，YINJingzheng1,2)，ZHANGRuifeng1,2)，TENGJunfang1,2)

1)DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince，Zhengzhou450052

TDP-25；autophagy；cell vitality;cell apoptosis

Aim: To investigate the effect of TDP-25 transfection on autophagy,vitality,and apoptosis of SH-SY5Y cells.Methods: The recombinated plasmids GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 were transfected into SH-SY5Y cells through eukaryotic cell transfection technique for 24 h,then immunofluorescence assay was performed to observe the form of ubiquitinated inclusions(UBIs), and the expressions of LC3 and Beclin-1 were detected using Western blot assay. SH-SY5Y cells were transfected with GFP-TDP-25, and treated with 3-MA,then the cell vitality was measured using MTT, and apoptosis was assayed with flow cytometry. Results:UBIs were localized at the cytoplasm in the cells of GFP-TDP-25 group.There were significant differences in the expression levels of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰamong GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 groups(F=192.700,247.420，P<0.05), and the expression level of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in GFP-TDP-25 group was the highest(P<0.05). Cell vitality of the cells transfected with GFP-TDP-25 and treated with 3-MA was lower and apoptosis rate were higher than cells only transfected with GFP-TDP-25(t=38.595,5.920，P<0.001).Conclusion: TDP-25 might weaken the cell damage through upregulating the level of macroautophagy.It maybe helps to inhibit the progress of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration through a proper regulation of macroautophagy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.022

*鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目 131PLJRC675

R742