豬腦微血管內(nèi)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)與鑒定

趙春雨，孔志偉，張?zhí)燔牵瑮钗钠G，楊連玉

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118；3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長(zhǎng)沙410125）

豬腦微血管內(nèi)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)與鑒定

趙春雨1，2，孔志偉3，張?zhí)燔?，2，楊文艷1，2，楊連玉1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118；3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長(zhǎng)沙410125）

探討獲取純度較高的原代豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。采用1月齡的三元雜交豬，通過(guò)兩次酶消化、BSA和Percoll非連續(xù)梯度離心獲得較純的腦微血管段后，接種于涂布有鼠尾膠的培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng)；相差顯微鏡觀察細(xì)胞并進(jìn)行純化和傳代，采用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h即可見(jiàn)細(xì)胞從貼壁的腦微血管段周?chē)莱觯?xì)胞呈短梭形，集落呈典型的“鵝卵石樣”，區(qū)域性單層生長(zhǎng)，6～7 d內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始融合，血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性。說(shuō)明本試驗(yàn)成功的培養(yǎng)出了純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，為后續(xù)的體外血腦屏障模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

豬；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；分離培養(yǎng)；免疫熒光

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain Microvascular Endo?thelial Cells，BMECs）是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能［1-2］。新近研究發(fā)現(xiàn)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有重要的屏障保護(hù)和半透膜的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)送作用，同時(shí)能分泌一些信號(hào)分子，這些信號(hào)分子在組織、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用［3-5］。由于原代分離的BMECs保留了在體環(huán)境下較多的特點(diǎn)，因此，體外培養(yǎng)的BMECs已被廣泛用于血腦屏障（Blood Brain Barri?er，BBB）功能研究、藥物篩選以及腦血管疾病研究等領(lǐng)域。

本研究利用兩次酶解法和非連續(xù)梯度離心法自仔豬腦皮質(zhì)分離BMECs，然后在涂布鼠尾膠的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行體外培養(yǎng)，得到較高純度和產(chǎn)量的BMECs，為進(jìn)一步研究BMECs的生物學(xué)行為和功能提供有用的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)采用1月齡左右的仔豬，購(gòu)自吉林省天惠牧業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑鼠尾膠BD（Biosciences，USA），Ⅱ型膠原酶、Triton X-100和DNA酶I（DNaseI），購(gòu)自Sigma公司；DMEM（高糖），購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS），購(gòu)自PAA公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF），購(gòu)自Pe?protech公司；牛血清白蛋白（BSA）和膠原酶/分散酶（collagenase/dispase），購(gòu)自Roche公司；Percoll原液，購(gòu)自Pharmacia公司；Hepes，購(gòu)自廣州博理生物科技有限公司；肝素鈉，購(gòu)自上海虹光化工廠；Ⅷ因子兔抗體，購(gòu)自DakoCytomation公司；TRITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，購(gòu)自上海滬峰化工有限公司；GFAP兔抗體，購(gòu)自Sino Biological Inc公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，購(gòu)自百浩生物科技有限公司。

1.3 主要試劑的配制非連續(xù)梯度Percoll液配制參照梁朝峰方法［6］。

1.4 培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿的處理接種前4 h，加入鼠尾膠濃度為6～10mg/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5～10min后，置于室溫1～2 h晾干后，用D-Hank′s液漂洗2次。

1.5 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)仔豬前腔靜脈放血致死后，取下頭顱，浸泡于75%乙醇中消毒3～5min，然后放入操凈臺(tái)中紫外照射3～5min，后打開(kāi)顱腔取出大腦，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管，置于含冷D-Hank′s液玻璃培養(yǎng)皿中，用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)，用D-Hank′s液漂洗3～5次后，加入1mL DMEM培養(yǎng)液，用虹膜剪將其剪碎成1mm3大小，加入少許D-Hank′s液沖洗，勻漿，將勻漿液通過(guò)200目濾網(wǎng)，用D-Hank′s液洗脫并收集濾網(wǎng)上的成分，1 500 r/min（4℃）離心5min，棄上清。將沉淀加入配制好的20%BSA溶液中混勻后4 000 r/min（4℃）離心20 min，離心后可見(jiàn)離心物分為3層，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部黃褐色沉淀。為了增加微血管的數(shù)量，可將離心后的中上層組織二次離心，取底部沉淀后，與第一次沉淀混合再進(jìn)行1次密度梯度離心后棄上清。將取得的最終沉淀物PBS洗1次，1 500 r/min（4℃）離心5 min，加入2 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶（內(nèi)含20μmol/mL D-NaseI）懸浮混勻后，37℃水浴震蕩消化30 min后，1 500 r/min（4℃）離心5min。沉淀加入2mLDMEM培養(yǎng)液，懸浮后鋪于配制好的非連續(xù)梯度的Percoll液的離心管中，1 500 r/min（4℃）離心25 min，位于最底層的為紅細(xì)胞層，其上富含微血管內(nèi)皮細(xì)胞的微血管段的黃白色層主要位于中間界面內(nèi)。

吸出純化的微血管段，用DMEM培養(yǎng)液漂洗二次，1 500 r/min（室溫）離心5min，去上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液，吹打均勻后接種于包被鼠尾膠的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，16 h后吸出未黏附的細(xì)胞雜質(zhì)及陳舊培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，隨后每2～3 d換液。

1.6 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

1.6.1 細(xì)胞形態(tài)觀察將培養(yǎng)有原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，觀測(cè)其生長(zhǎng)規(guī)律。

1.6.2 內(nèi)皮細(xì)胞的第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定鑒定方法參考Hoyer等的方法［7］，稍作改動(dòng)。具體方法為：取已純化好的細(xì)胞，消化傳代接種于放有細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合狀態(tài)時(shí)，取出培養(yǎng)板，棄掉培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS漂洗3 min/次-1×3次；向培養(yǎng)孔內(nèi)加入95%乙醇，加入量以覆蓋住細(xì)胞培養(yǎng)層即可，-20℃固定45min；PBS漂洗5min/次-1×3次；滴加兔抗鼠第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清（1∶100稀釋?zhuān)幮詫?duì)照不加），37℃孵育60min；PBS漂洗5min/次-1×3次；滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶100稀釋?zhuān)?7℃孵育45min；PBS漂洗3 min/次-1×3次，然后用去離子水洗滌1次；甘油封片，并用潔凈蓋玻片覆蓋細(xì)胞層，于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄（顯微鏡預(yù)熱2 h）。

1.6.3 MTT法測(cè)定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將細(xì)胞按1×104/mL密度同時(shí)接種于10塊96孔板，每孔接種200μL，共設(shè)8個(gè)平行孔，每天收集1塊96孔板，將培養(yǎng)液吸去，每孔加入無(wú)血清的200μLM199，20μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心5min，棄上清，每孔加入200μL DMSO溶解紫色結(jié)晶，振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A），可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，并做生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果接種當(dāng)時(shí)可見(jiàn)串珠狀的微血管段，或者是單支狀和多支狀的微血管段。培養(yǎng)16 h后，絕大部分細(xì)胞已經(jīng)完成貼壁，24 h后，組織碎片或者微血管段周?chē)屑?xì)胞長(zhǎng)出（圖1），呈短梭型，3 d后可見(jiàn)細(xì)胞大量增殖（圖2），5 d后細(xì)胞單層區(qū)域性生長(zhǎng)（圖3），7 d后細(xì)胞基本上達(dá)到融合（圖4）。融合的細(xì)胞呈典型的“鋪路石狀”。

圖1 細(xì)胞少量遷出

圖2 細(xì)胞大量增殖

圖3 細(xì)胞單層區(qū)域生長(zhǎng)

圖4 細(xì)胞匯合成片

2.2 第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果第Ⅷ因子相關(guān)抗原染色為陽(yáng)性，細(xì)胞核空染，而細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出黃綠色熒光，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間具有明顯的界限（圖5）。由此可見(jiàn)，本研究所采用的方法成功培養(yǎng)出BMECs。

圖5 細(xì)胞Ⅷ因子抗體鑒定結(jié)果（A）×200，（B）×400

2.3 MTT法測(cè)定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線用MTT法測(cè)定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)在第4天時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)高峰期，第8天時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。

圖6 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

3 討論

BMECs的培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代末，其培養(yǎng)的關(guān)鍵在于腦微血管段的分離，主要表現(xiàn)在分離步驟較為繁雜［8］。本試驗(yàn)主要是為了探索一種更好的分離培養(yǎng)豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，為建立一種良好的體外血腦屏障模型奠定基礎(chǔ)。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的的分離培養(yǎng)已經(jīng)有很多報(bào)道。大部分都是運(yùn)用的新生的大鼠腦皮質(zhì)［6，9-11］或者是人臍靜脈［13-16］作為材料。也有用豬［17］作為試驗(yàn)材料的，但是分離培養(yǎng)出高純度、高產(chǎn)量的微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）仍然面臨許多困難。

豬BMECs的分離，不僅會(huì)因?yàn)檐浤X膜、腦膜大血管等去除不凈而受到神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染，而且也會(huì)因日齡的差異而受到影響。本試驗(yàn)參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［17-20］，并進(jìn)行一些改進(jìn)。主要概括如下：（1）取材選用1月齡大小的仔豬在低溫下盡量去除軟腦膜、大血管及大腦白質(zhì)，收集大腦皮質(zhì)；（2）由于BMECs嬌嫰易損，分離細(xì)胞時(shí)采用兩次酶消化法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的組織勻漿法，避免組織勻漿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷，以利于提高細(xì)胞的活力；（3）由于采用酶消化法，分離的內(nèi)皮細(xì)胞常被成纖維細(xì)胞等污染，為了去除更多的雜細(xì)胞，我們根據(jù)Percoll細(xì)胞分離液不同濃度對(duì)應(yīng)不同比重值的細(xì)胞，用非連續(xù)梯度的Percoll分離液進(jìn)行分離，從而得到純度更高的微血管段；（4）為提高原代培養(yǎng)的BMECs貼壁速度，在原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶尚涂布鼠尾膠等基質(zhì)能促進(jìn)腦微血管段的貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而提高了傳代的BMECs的純度；（5）選擇合適的種植密度。我們發(fā)現(xiàn)種植的微血管片斷密度在20條/cm2以上效果較好；（6）為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并抑制雜細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們采用含有bFGF，EGF，以及20% FBS血清的高糖培養(yǎng)液，以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)添加100mg/L肝素鈉協(xié)同bFGF的作用可抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，培養(yǎng)出了純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以為后續(xù)的與星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型服務(wù)，更好的模擬體內(nèi)的環(huán)境，進(jìn)一步為篩選促生長(zhǎng)的天然生物活性物質(zhì)提供簡(jiǎn)便快捷的方法。

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Primary Isolation，Culture and Idendtification of Pig CerebralM icrovascular Endothelial Cells

ZHAOChun-yu1，2，KONG Zhi-wei3，ZHANG Tian-rui1，2，YANGWen-yan1，2，YANG Lian-yu1，2
（1.College of Animal Science and Technology.Jilin Agriculatural University.Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of，Animal Nutrition and Feed science of Jilin Province，Changchun 130118，China；3.Key Laboratory of Processes of Agro-eco-system，Institute of Subtropical Agriculture，the Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China）

This study was designed to developan isolation and culturemethod to get higher purity of pig brainmicrovascular endothelial cells（BMEC）.After relatively pure cerebralmicrovessel fragmentswere obtained from 1month old Landrace by careful dissection，and two steps of enzyme digestions and gradient centrifugation with BSA and Percoll were performed，the fragments were seeded on dishes coated with rattail collagen.PBMECwere identified according to themorphology of the cultured cells and im?munocytochemistry of factor VIII-associated antigen.We found that the cultured cells began tomigrate from microvessel fragments after 24 hours cells showed the spindle-shapedmorphology and looked like"slabstone"，ar typical appearance of cultured endotheli?al cells under inverted microscope and reached themonolayer confluence after 6～7 days.Our cultured cells had factor VIII-asso?ciated antigen.The results indicated that relatively pure primary culture of PBMEC was successfully established.

Pig；BMEC；Isolation and culture Corresponding author：YANG Lian-yu

S858.28

A

0529-6005（2015）12-0023-04

2014-07-15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31302002）；吉林省教育廳項(xiàng)目（201252）

趙春雨（1989-），男，碩士生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：chunyu198911@163.com

楊連玉，E-mail：yangly2004@126.com