煙草內生細菌YN201448的定殖能力研究

楊珍福，何鵬飛，3，吳毅歆，毛自朝，何月秋，2*

（1.云南農業大學植物保護學院，昆明 650201；2.云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201；3.微生物菌株篩選與應用技術國家地方聯合共建工程中心，昆明 650471）

煙草內生細菌YN201448的定殖能力研究

楊珍福1，何鵬飛1，3，吳毅歆2，3，毛自朝2，3，何月秋1，2*

（1.云南農業大學植物保護學院，昆明 650201；2.云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201；3.微生物菌株篩選與應用技術國家地方聯合共建工程中心，昆明 650471）

摘要：為測定煙草內生細菌YN201448的定殖能力，通過自然轉化法將攜帶綠色熒光蛋白基因的質粒pGFP4412成功導入YN201448細胞中，獲得了GFP標記菌株48-pGFP。48-pGFP能穩定表達GFP蛋白，且對5種病原真菌的拮抗能力與野生型YN201448的相同。用48-pGFP菌液浸泡煙草種子和澆灌煙草苗后，在煙草的根、莖、葉等組織中都能檢測到標記菌，其定殖數量分布為根＞莖＞葉；同時標記菌也能在根際土中穩定地定殖。激光共聚焦顯微鏡觀察發現標記菌株主要聚集在煙草莖組織的表皮、皮層部位及維管組織。因此，YN201448可以在煙草體內外較長期定殖。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；綠色熒光蛋白；拮抗作用；自然轉化

植物體內存在大量的內生細菌，它們因植物組織的保護，而免受外部惡劣環境的影響，對植物具有廣泛的生物學作用［1-3］。利用植物內生細菌作為生物制劑或生物肥料對植物進行生物預處理具有廣闊的應用前景，掌握其定殖情況是進行生產應用的前提［4-5］。目前用于檢測內生細菌在植物體內定殖的方法包括抗生素標記法、基因標記法、同位素示蹤法、DNA和RNA探針法、免疫學方法等［6］。過去應用較為廣泛的是抗生素標記法，該法雖然簡便、快速、消耗低且結果可統計分析，但其精確性低、回收下限高［7］。近年來隨著分子生物學技術的不斷發展，基因標記技術越來越為人們重視，其中綠色熒光蛋白（GFP）由于具有性能穩定、檢測方便、靈敏度高的特點已被成功用于觀察細菌侵入植物的過程以及細菌在植物組織中的具體定殖部位［8-11］。

YN201448是從煙草體內篩選的內生解淀粉芽孢桿菌，平板對峙試驗表明其對多種病原菌有抑制作用，經溫室試驗和田間使用證明其對煙草黑脛病有很好的防病作用，且對多種作物具有促生長作用。本研究運用質粒的接合轉移方法對YN201448進行GFP標記，將GFP質粒轉到YN201448菌株中，獲得具有綠色熒光的菌株48-pGFP，這使我們實時動態地監測其在煙草體內外的定殖情況成為一種可能。研究YN201448菌株在煙草上的定殖情況，有助于進一步了解該菌株的防病促生機制，也為今后進一步開發成植物生防制劑和促生菌劑提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株：煙草內生解淀粉芽孢桿菌YN201448，真菌病原菌：煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、禾谷鐮刀病菌（Fusarium graminearum）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）、番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）等均為本試驗室分離保存。

質粒：含有卡那霉素抗性基因的pGFP4412質粒由中國農業大學王琦教授惠贈。供試煙草：云煙97品種5～6葉期煙苗。細菌增殖采用LB培養基，自然轉化生長采用GCHE和GC培養基［12］。

1.2方法

1.2.1拮抗細菌YN201448的GFP標記解淀粉芽孢桿菌YN201448的自然轉化，采用Idris等［12］提供的兩步法。將轉化成功的菌株經不含卡那霉素的 LB 培養液和平板交替繼續培養5輪，再回接到含卡那霉素的LB平板上檢測，以證實其質粒表達的穩定性。

1.2.2GFP標記菌株與YN201448野生菌株拮抗能力的比較測定采用平板對峙［13］試驗比較GFP標記菌株和野生型YN201448菌株對植物病原真菌的室內拮抗活性，其中植物病原真菌以煙草黑脛病病菌、禾谷鐮刀病菌、玉米彎孢霉葉斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等為試驗材料。當空白對照的病原菌長滿平板時，觀察接種拮抗菌的培養皿中拮抗帶寬度的變化，對比兩者的拮抗帶寬度，得出標記菌是否具有相同的拮抗能力，以此來判斷其是否適用于定殖和生物防治研究。

1.2.3GFP標記菌在煙草體內外的定殖研究（1）浸種處理：云煙97種子經酒精消毒后，用標記菌菌懸液（1.00×107cfu/mL）浸泡24 h，取出種子，用滅菌水沖洗4次后置于墊有濕潤濾紙的培養皿內，于28 ℃光照培養箱中保濕培養。種子發芽后取0.5 g幼苗，用酒精消毒后，再用無菌水沖洗4次。將植物組織研磨成漿狀物，并稀釋成不同濃度，靜置3 min。取150 μL汁液涂抹于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，28 ℃下黑暗培養48 h，在紫外投射儀照射下統計平板上發綠色熒光的菌落數，計算含菌量［（菌落數×稀釋倍數×分離用水毫升數）÷（涂板用水毫升數×分離組織克數）］。以清水浸種為對照，每處理重復3次。

（2）灌根處理：將長勢一致的5～6片真葉期的煙草苗根拔起洗凈后移栽在裝有未滅菌自然土的花盆中后，用GFP標記菌菌液（1.00×107cfu/ml）灌根處理。分別于處理后第1、5、10、25、50天取樣，測定拮抗細菌在煙草根、莖、葉內的定殖情況。以煙草根灌清水為對照，每處理重復3次。在組織分離的同時，稱取煙草根際土于無菌水中，搖床震蕩30 min后，進行一系列梯度稀釋后涂布在含有卡那霉素的LB平板上，測定標記菌在根際土中的菌落變化情況。選擇處理1 d和10 d后的煙草樣品，切取用無菌水清洗過的煙草根、莖組織，壓片法制片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標記菌株在煙草體內的定殖情況，以不接菌的煙草植株作為對照。

2　結　果

2.1解淀粉芽孢桿菌YN201448的轉化

按照Idris等［12］提供的方法，我們成功地將pGFP4412質粒導入解淀粉芽孢桿菌YN201448自然感受態細胞中。pGFP4412標記的YN201448熒光明顯，在抗生素平板上肉眼可見淺黃色菌落，其在紫外投射儀下菌落發出明亮的綠色熒光（圖1），轉化菌株命名為48-pGFP。48-pGFP經不含卡那霉素的LB培養液和平板交替繼續培養5輪，再回接到含卡那霉素的LB平板上能正常生長，且綠色熒光明亮，說明標記菌株質粒能穩定表達。

2.248-pGFP與野生型菌株室內拮抗活性的比較

在平板對峙試驗中，與YN201448菌株的野生型相比較（圖2），48-pGFP菌株對病原真菌煙草黑脛病病菌、禾谷鐮刀病菌、玉米彎孢霉葉斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等的拮抗能力與野生型的相同。說明標記后菌株對病原菌的抑制作用未受到影響，適用于定殖和生物防治的研究。

圖2　YN201448菌株和GFP標記菌株對病原真菌抑菌活性Fig. 2　Inhibitory effect of GFP-tagged YN201448 and its own wild type on phytopathogenic fungi

2.348-pGFP在煙草體內和體外的回收監測

在浸種處理的實驗中，清水對照處理中回收不到菌落，而用48-pGFP處理后長出的煙草幼芽中可以回收到1.07×104cfu/g發熒光的菌落。灌根試驗的結果如圖3所示，在根際土、根、莖、葉中，隨著移栽后時間的延長，標記菌株的定殖密度有所下降。在用48-pGFP菌液處理后的第1天，在根、莖和葉組織中回收到的菌落數分別為8.59×105、3.35×105和7.44×104cfu/g，在第5天時菌落數有所下降，到第10天時處于上升狀態，之后開始下降，到第50天時，煙草根、莖和葉組織中仍回收到2.53×105、4.10 ×102和4.44×102cfu/g的菌落。煙草根際土中的前10 d，48-pGFP處于緩慢增長的狀態，到第10天時根際土中回收的菌落數達1.66×107cfu/g，之后逐漸下降，到第50天時回收到的GFP標記菌為2.00×105cfu/g。在處理后第25天對煙草組織進行表面消毒和不消毒處理后發現（圖4），表面消毒過的只有未表面消毒的煙草組織中菌落數的1/10，說明YN201448菌株在植物表面也能夠大量定殖。在處理第50天后煙草各組織和土壤中回收的48-pGFP菌落在抗生素平板上形成的菌落成淺黃色菌落是肉眼可見的，在紫外投射儀下能看到明顯的熒光，說明GFP標記菌株比較穩定。處理后的第1天，48-pGFP在煙草根系上的定殖情況如圖5a所示，在激光共聚焦顯微鏡下可以清楚的看到經過48-pGFP處理的根表呈現出很強的綠色熒光，比對照煙草根系中微弱的自發熒光（圖5b）強得多；在莖組織切片中有標記菌的蹤跡，且48-pGFP主要聚集在莖的表皮和皮層部位（圖5d）。在處理后的第10天，煙草根表的綠色熒光信號更加強烈（圖5c），與分離培養檢測菌落數結果相符，同時在莖的維管組織細胞中（圖5f）也能檢測到48-pGFP。

煙草組織中標記菌落的回收結果和熒光顯微鏡觀察結果都表明，48-pGFP能夠進入煙草植株內部，并在煙草體內傳導。菌株在進入到莖組織后，首先在表皮和皮層上定殖，然后向上傳輸到達葉片中，同時已定殖在表皮和皮層上的標記菌株也會向莖內部的維管組織中橫向移動。煙草根際土中菌落回收結果表明，48-pGFP能在土壤中很好的定殖。由此表明，48-pGFP能夠很好的在煙草體內外傳導和定殖。

圖3　48-pGFP在煙草體內外的定殖動態Fig. 3　Population of 48-pGFP in tobacco seedling and rhizosphic soil

圖4　第25天時煙草組織中的48-pGFP菌落數Fig. 4　Population of 48-pGFP 25 days after inoculating tobacco

圖5　標記菌48-pGFP在根表和莖組織中的定殖Fig. 5　The colonization of GFP-tagged strain， 48-pGFP in tobacco root and in stem tissues

3　討　論

植物內生細菌作為新挖掘的微生物資源，正在被廣泛開發利用，相對于其他植物來說，煙草內生菌研究及開發較少，其應用潛力巨大［14］。內生有益細菌在其寄主或其他植物中穩定定殖是其發揮防病促生作用的重要前提［15-16］。目前已有許多研究生防菌在植物體內定殖情況的方法，其中GFP標記具有操作簡單、檢測方便、無需外源底物等優點，已經成為當代研究目標微生物在自然環境中的釋放、生存、定殖以及與其他微生物或植物互作等最為成功的報告基因［11，17-19］。YN201448是一株具有促生長、防治煙草黑脛病的煙草內生細菌［20-21］。本試驗以GFP成功地標記了該菌株，從而為研究其在煙草植株不同部位的分布狀況、定殖規律、促生長和防病機制提供了有力工具。

以標記菌株48-pGFP浸種和灌根處理，證明48-pGFP能在煙草體內定殖，灌根處理時，它在煙草根、莖、葉內的定殖能力為：根＞莖＞葉，表明該菌株進入煙草苗的根系后，能夠轉移到植株的莖和葉部組織。定殖數量動態在煙草的根、莖、葉等組織中均呈現“減-增-減”的變化趨勢，且在根內的數量變化明顯比莖和葉內的平緩，此結果與前人在其他作物上進行的定殖研究結果一致［22-24］。生防菌在根部定殖能力的強弱決定著生防的成敗［6］，有益內生細菌B946［7］在小麥體內，固氮菌DX120E［25］在甘蔗體內均能很好定殖，但只有當定殖達一定數量時，才能有效阻止病原菌侵染植物。本研究中48-pGFP在煙草體內的定殖隨著植株的生長有所減少。因此，為了更好地發揮其防病促生長作用，在實際應用中可以根據需要適當補施，來保證YN201448在煙草體內的定殖菌落數。由于菌株經過GFP標記不能在大田中做相關試驗，為了接近大田生長情況，本試驗采用未滅菌的自然土來做定殖研究，表明野生型菌株YN201448亦能在自然土中很好定殖。

4　結　論

本研究獲得了煙草內生解淀粉芽孢桿菌YN201448的GFP標記菌株48-pGFP，并通過對峙試驗證明標記菌株對5種病原真菌的拮抗能力與野生型菌株的相同，用48-pGFP菌液對煙草進行浸種和灌根處理，均能回收到標記菌株，表明YN201448能在煙草體內外很好的定殖，具有進一步開發成植物生防制劑或促生菌劑的潛力。

致謝：感謝中國農業大學植物病理系王琦教授無私地惠贈帶卡那霉素抗性基因的質粒pGFP4412。

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中圖分類號：S435.72

文章編號：1007-5119（2015）03-0080-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.016

基金項目：科技部國際科技合作項目“防治植物病害和促進植物生長的微生物開發應用及機制研究”（2009DFA326360）；中國煙草總公司云南省公司項目“普洱市烤煙‘兩黑病’綜合防控技術研究與應用”（2015YN26）

作者簡介：楊珍福（1988-），碩士研究生，主要研究方向為植物病理學。E-mail：ynjcyzf152@126.com。*通信作者，E-mail：ynfh2007@163.com

收稿日期：2014-08-31修回日期：2015-03-30

The Colonization of Endophytic Bacterium YN201448 in Tobacco

YANG Zhenfu1， HE Pengfei1，3， WU Yixin2，3， MAO Zichao2，3， HE Yueqiu1，2*
（1. Faculty of Plant Protection， Yunnan Agricultural University （YAU）， Kunming 650201， China； 2. Faculty of Agronomy and Biotechnology， YAU， Kunming 650201， China； 3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains， Kunming 650471， China）

Abstract:In order to determine the colonization of endophytic bacterium YN201448 in tobacco， we successfully obtained a stable GFP tagged strain 48-pGFP by transferring the pGFP4412 plasmid into YN201448 via natural transformation. 48-pGFP showed the same antagonistic effect against 5 pathogenic fungi as the wild strain YN201448. 48-pGFP was observed to be distributed in root， stem and leaf tissues of tobacco after its seeds soaked and seedling roots drenched with 48-pGFP. The colonizing bacterium decreased with the trend of root ＞ stem ＞ leaf， and 48-pGFP could colonize in rhizospheric soil stably. Fluorescence microscope observation indicated that 48-pGFP mainly appeared in tobacco stem epidermis， cortex and vascular tissue cells. Therefore， YN201448 could colonize inside and around tobacco plant stably for a relatively long period of time.

Keywords:Bacillus amyloliquefaciens； GFP； antagonistic effect； natural transformation