高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在分析檢測中的運用分析

關(guān)金龍

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

0 引言

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography andmassspectrometry，HPLC/MS）是以高效液相色譜為分離手段，以質(zhì)譜為鑒定工具的一種分離分析技術(shù)。20世紀(jì)70年代，自Horning對高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了開創(chuàng)性的研究，到20世紀(jì)90年代出現(xiàn)了被廣泛接受的商品接口及成套儀器[1]，它將高效液相色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，逐漸成為強有力的分析技術(shù)方法[2-12]。

1 液相色譜-質(zhì)譜的優(yōu)點

在液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）中，質(zhì)譜可對復(fù)雜樣品進(jìn)行分析，即使在液相色譜難以分離的情況下，只要通過質(zhì)譜儀1及質(zhì)譜儀2對目標(biāo)化合物進(jìn)行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混合物中的目標(biāo)化合物，其結(jié)果可顯著提高信噪比。

在藥代動力學(xué)研究方面，LC-MS/MS與傳統(tǒng)的方法相比，其具有一系列優(yōu)點：（1）對生物樣品的提取、純化和濃縮等前處理過程沒有嚴(yán)格要求；（2）具有極高的靈敏度，特別適合進(jìn)行痕量分析；（3）對蛋白質(zhì)可實現(xiàn)快速高靈敏度鑒別和測定；（4）可實現(xiàn)微量、高通量樣品分析；（5）檢測所需時間短、回收率高、專屬性強。

2 分析方法

2.1 質(zhì)譜條件確立

當(dāng)使用液質(zhì)聯(lián)用儀對某一化合物進(jìn)行定量分析時，需要建立一個質(zhì)譜分析方法，主要考慮以下幾種因素：

2.1.1 化合物的性質(zhì)

化合物的性質(zhì)包括化合物的結(jié)構(gòu)、化合物的極性及化合物的pKa值。首先，通過了解化合物的結(jié)構(gòu)，可以大概推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量反應(yīng)的子離子，也可以根據(jù)經(jīng)驗判斷選用哪種離子源更為合適；其次，根據(jù)化合物的極性大小，可以選擇一種或幾種恰當(dāng)?shù)娜軇┳鳛槿苊剑饶鼙ＷC完全將樣品溶解，又能提高化合物的質(zhì)譜響應(yīng)；最后，了解清楚化合物的pKa值，有助于選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質(zhì)譜響應(yīng)值。

2.1.2 流動相添加劑的選擇

在液質(zhì)分析中，基于質(zhì)譜檢測的原理，只能使用可揮發(fā)的酸堿或緩沖鹽，種類就會受到極大的限制。在日常分析中使用到的添加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽。

2.1.3 質(zhì)譜離子源的選擇

質(zhì)譜出現(xiàn)早期，主要的離子源有電子轟擊源（EI）、化學(xué)電離源（CI）、電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，離子源的發(fā)展也是日新月異。目前，用于定量的離子源主要是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。

2.2 色譜條件的建立

在液質(zhì)分析中，經(jīng)常使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM/SRM）對化合物進(jìn)行定量，由于MRM要求選擇2次離子，因此具有很高的專屬性。基于這點對多個化合物同時進(jìn)行檢測時，不需要彼此間達(dá)到完全分離就可以進(jìn)行定量分析。

2.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

檢測時，使用內(nèi)標(biāo)物的目的是消除操作誤差，因此在進(jìn)行生物樣品分析時必須選擇一個合適的化合物作為內(nèi)標(biāo)物。LC-MS/MS法的高專屬性使其對內(nèi)標(biāo)物與待測物的色譜分離要求不高，但要求內(nèi)標(biāo)物與待測物的色譜行為及提取回收率，尤其是質(zhì)譜信號響應(yīng)值接近，并要求在測定過程中內(nèi)標(biāo)物受系統(tǒng)誤差及碰撞壓力變化的影響與待測物一致。因此，理想的內(nèi)標(biāo)物應(yīng)為待測組分的同位素標(biāo)記物，但由于同位素標(biāo)記物價格非常昂貴且不易獲得，可嘗試選用結(jié)構(gòu)相似的化合物（或者同系物）作為內(nèi)標(biāo)物。

3 LC-MS/MS技術(shù)在分析檢驗中的應(yīng)用

LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)以其高靈敏度、高分離能力和極強的專屬性等特點，且其儀器自動化、普及化程度越來越高，使其被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境分析、藥物分析和食品分析等眾多領(lǐng)域。

3.1 天然藥物化學(xué)成分分離和鑒定

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在天然藥物成分分析研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

He等[13]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成功地對姜的辛辣成分與含油樹脂提取物進(jìn)行了成功分析，成功地鑒定了其中7個化合物結(jié)構(gòu)。

3.2 藥物動力學(xué)和藥物代謝產(chǎn)物研究

中藥制劑成分復(fù)雜多樣，含量一般較低，而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的專一性及靈敏度對中藥的藥代動力學(xué)研究具有重要意義。

M.Jemal等[14]綜述了藥物研究中用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行高通量生物分析的發(fā)展，艾路等采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了方劑中烏頭類的生物堿含量。

3.3 中藥指紋圖譜研究

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用為藥材及其制劑的鑒別及質(zhì)量評價提供了更加全面、可靠的依據(jù)。

余靜[15]等采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對刺五加藥材水溶性和脂溶性成分進(jìn)行了指紋圖譜研究。

3.4 藥物殘留分析

食品中的農(nóng)藥殘留量及其有害成分的含量甚微需要對其進(jìn)行痕量分析。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有極高的靈敏度，可鑒別和測量各種類型的農(nóng)藥以及生物毒素等殘留物。

Yoshioka等[16]應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時分析了柑橘果實中的4種催熟劑。

3.5 臨床診斷研究

Orhan等[17]建立了采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測3種氧化產(chǎn)物的方法。

4 結(jié)語

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，以其靈敏、快速、高效等特點，在對含量少、不易分離得到或缺乏紫外吸收的物質(zhì)的分析中顯示了獨特的優(yōu)勢。

綜上所述，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在分析檢測方面應(yīng)用前景廣闊，將在現(xiàn)代分析檢測研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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