快速測定植物油膽固醇含量在地溝油篩查中的應用

何文絢等

摘 要 采用皂化氣相色譜氫火焰離子檢測器法測試了多個植物油樣品，發現膽固醇峰被干擾比較嚴重，很難得出植物油與地溝油膽固醇含量的界定值。采用SPE進行樣品前處理，對SPE處理條件進行優化，得出優化條件為稱樣量0.25 g ，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 作為淋洗液，20 mL 15% 乙醚正己烷 （V/V） 作為洗脫液。用SPE氣相色譜氫火焰離子檢測器法分析了84個植物油樣品和13個地溝油樣品中膽固醇含量，測定結果表明，植物油膽固醇含量與地溝油膽固醇含量有明顯區別，所有植物油膽固醇含量都小于50 μg/g，13個地溝油樣中11個樣膽固醇含量大于50 μg/g。因此，采用上述植物油膽固醇測定方法，膽固醇含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油，反之不成立。本方法在0～760 mg/L濃度范圍內相關系數R2=0.9999，方法檢出限為6.0 μg/g，兩個濃度水平（17.7和695 mg/L）的相對標準偏差分別為1.6% 和1.5%，回收率為103%。

關鍵詞 地溝油； 氣相色譜； 固相萃取； 植物油； 膽固醇

1 引 言

關于地溝油檢測方法研究有許多是通過分析植物油中膽固醇含量來判定是否為地溝油[1～4]，且多采用氣相色譜法測定膽固醇。雖然相關文章較多，獲得實際植物油膽固醇含量數據卻非常有限，氣相色譜法測定膽固醇鑒定地溝油在實際應用中還存如不同制樣法分析結果相差較大、氣相色譜氫離子火焰檢測器分析結果明顯高于氣相色譜質譜聯用法等問題。液相色譜質譜聯用或氣相色譜質譜聯用測定膽固醇選擇性好，但由于離子化效率對準確定量有很大影響，通常采用同位素內標彌補相關的不足，所以目前靈敏度、精密度、準確度高的膽固醇測定方法應多反應監測同位素內標液質聯用[5]和同位素內標氣質聯用法[6]，但兩種方法成本高、操作繁瑣，擁有相關儀器的單位較少。地溝油多數情況下混有動物脂肪，也必定含有動物油脂的特征性甾醇——膽固醇，但若不經篩查，直接采用上述同位素內標液相色譜質譜或氣相色譜質譜聯用方法，由于高昂的成本和相對少的儀器，實際應用中很難操作。高效的做法應是用相對價廉、簡單、有效的方法先篩查疑似地溝油，篩出的少量疑似地溝油樣品再用成本高、準確性好的方法確證，這樣建立的方法才有實際應用基礎。膽固醇是地溝油的關鍵指標之一，可以用其作為篩查指標，篩查階段不需要太強調獲取準確膽固醇含量數據，但需滿足以下條件：第一，測得的數據地溝油與植物油要有明顯區別；第二，方法重現性好，可以得到明確、誤判率低的判定設定值；第三，方法相對簡單、經濟、省時。基于此，本研究建立了測定植物油中膽固醇含量快速篩查地溝油的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與樣品

GC2014C氣相色譜儀，配FID檢測器（日本島津公司）。SPE硅膠柱（500 mg/3 mL，菲羅門科學儀器有限公司）。石油醚（沸程30～60 ℃）、無水硫酸鈉、無水乙醇、正己烷、無水乙醚、KOH均為分析純。

所有菜籽油、葵花油、大豆油、玉米油、芝麻油、花生油、橄欖油都購于大型超市，地溝油都是相關部們查獲、有確鑿證據的樣品。

2.2 膽固醇標液配制

準確稱取0.0192 g膽固醇（純度>99%，美國NUCHEK公司），用正己烷溶解并稀釋至25 mL，配制成760 mg/L的膽固醇標準儲備液，在4 ℃下保存。根據需要用正己烷稀釋成適當濃度標準溶液。

2.3 樣品前處理

2.3.1 皂化 稱取1.00 g（±0.01 g） 樣品，置于燒瓶中，加入1 mol/L KOH乙醇溶液10 mL，在90 ℃水浴鍋上皂化1 h，冷卻，移入60 mL分液漏斗，以10 mL去離子水洗滌，洗液并入分液漏斗，再以10 mL石油醚洗滌，洗液并入分液漏斗，輕輕振搖，靜置分層，分出有機相和水相，水相加入10 mL石油醚振搖，分層后，將石油醚層并入有機相，以10 mL石油醚再提取一次，提取的石油醚并入有機相。用2～3 mL去離子水洗滌有機相，分層，棄去水相， pH試紙檢測水相，若pH>7，重復此步驟，直至pH=7。無水Na2SO4干燥后，將石油醚層移入25 mL玻璃蒸發皿，吹干，用正己烷將殘余物轉移到1.5 mL樣品瓶，4 ℃下保存，測試時用正己烷定容。

2.3.2 SPE法條件優化 文獻[6]已詳細探討用SPE法測試植物油中膽固醇條件，但未標出所用的SPE小柱基本信息。本研究以該文獻為基礎，進行SPE條件優化。稱取S2（見表1）試樣0.25 g（±0.01 g） 于10 mL 具塞比色管中，加入0.1 mL膽固醇標準儲備液（760 mg/L）， 用5.0 mL 正己烷溶解后作為上樣液。SPE柱內加入1 g無水Na2SO4，10 mL 正己烷活化小柱，棄去流出液，按以下步驟進行上樣、淋洗和洗脫：（1）上樣 加入上樣液，棄去流出液，用5 mL正己烷分3次潤洗比色管，潤洗液加入柱內，棄去流出液；（2）淋洗 將20 mL 0.6% 乙醚正己烷（V/V）溶液分2次加入，第一次加15 mL，第二次加5 mL，收集5 mL流出液，該淋洗液編號L1；（3）洗脫 將20 mL 15%乙醚正己烷溶液（V/V）分成3次加入，第一次加10 mL，后面兩次各5 mL，分別收集流出液，相應洗脫液編號為X1、X2和X3。以上步驟都是用玻璃蒸發皿收集流出液，冷風吹干正己烷，用適量正己烷將蒸發皿中殘留物轉移到1.5 mL試樣瓶，放置在4 ℃冰箱中，測試前用正己烷定容。

2.4 氣相色譜分析

色譜柱：Rtx5毛細管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氮氣； 柱流量：130 mL/min； 檢測器：FID（溫度320 ℃）； 進樣口溫度：300 ℃； 進樣方式： 分流（1∶90）； 程序升溫：200 ℃保持5 min； 以20 ℃/min升溫至280 ℃，并保持10 min； 再以35 ℃/min升溫至310 ℃， 保持5 min。endprint

3 結果與討論

3.1 SPE條件最佳化

固相萃取方法參照文獻[6]，并加以改進：在SPE小柱中添加了無水Na2SO4，將稱樣量降低至0.25 g，洗脫液乙醚含量從10%增加至15%，采用蒸發皿收集洗脫液并用常溫空氣吹干，簡化了揮干溶劑步驟，花生油318經SPE處理后色譜圖如圖1。

實驗表明，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 淋洗液未將膽固醇洗出（L1未檢出膽固醇）；10 mL 15%乙醚正己烷 （V/V） 洗出73.5%的膽固醇（X1膽固醇回收率達73.5%）；當15%乙醚正己烷 （V/V） 洗脫液用量達到15 mL時，膽固醇已全部被洗出（X1+X2膽固醇回收率為103.7%，X3未檢出膽固醇）。為了保證膽固醇被完全洗出，選擇20 mL 15%乙醚正己烷（V/V）作為洗脫液。

3.2 樣品前處理比較

22個樣品分別用SPE和皂化法處理，氣相色譜氫離子火焰檢測器外標法測定膽固醇含量，分析結果見表1。由表1可知，皂化法結果高于SPE法，皂化法很難給出正常油與地溝油膽固醇含量的界定值，目前未發現已發表的國內文獻提及該結論； SPE法測試結果中所有植物油膽固醇含量都小于50 μg/g； 地溝油皂化法和SPE法測得的膽固醇含量基本相同，且75%的地溝油樣SPE法得到的膽固醇含量高于50 μg/g。表1數據顯示許多合格植物油，皂化法測定的膽固醇含量都超過文獻 [7] 規定的判別設定值（50 μg/g），說明皂化法不適合用于地溝油的篩查。

3.3 皂化法測試結果高于SPE法的原因探討

依據文獻[8，9]，植物油中甾醇有兩種狀態：酯化狀態和游離狀態，皂化法測得的是總膽固醇含量（酯化+游離），SPE法測的只是游離膽固醇含量，文獻[8]就是用皂化法測總膽固醇，用SPE法測游離膽固醇，不同植物油酯化和游離甾醇的比例不同，例如葡萄籽油中酯化膽固醇與游離膽固醇比例約為4∶6。皂化法測定的是酯化膽固醇+游離膽固醇含量而SPE法測定的只是游離膽固醇含量，這是皂化法結果高于SPE法的第一個原因；植物油成分復雜[10]，其他植物甾醇、植物醇、未知物等成分的保留時間與膽固醇相近[11]，用氣相色譜分析時這些成分時，無法與膽固醇分離，表1中SPE法測得的膽固醇含量明顯高于文獻 [6]（同樣的樣品前處理方法及氣相色譜分析條件）同位素內標氣質聯用法，證實了氣相色譜氫離子檢測器法測定膽固醇存在甾醇等物質的干擾。皂化法由于釋放出了酯化甾醇（植物油中有些甾醇含量比膽固醇高1個或幾個數量級），將對膽固醇測定產生嚴重干擾，所以皂化法甾醇類物質的干擾幾率和程度都比SPE法高，這是皂化法測試結果高于SPE法的第二個原因；地溝油皂化法和SPE的結果基本相同，這是因為地溝油在加工過程中經歷了長時間堿煉，已將酯化的甾醇類物質釋放成游離甾醇，所以二者測試結果基本相同，這也驗證了前述的第一和第二個原因；皂化法無法消除植物醇的干擾，但SPE法中，植物醇在用5% 乙醚正己烷淋洗時已被除去，因此植物醇的存在是皂化法結果高于SPE法的第三個原因。

3.4 SPE樣品前處理氣相色譜分析膽固醇方法評價

3.4.1 線性范圍 配制7.6， 76， 152， 304和760 mg/L膽固醇溶液，進行線性回歸實驗。結果表明，膽固醇濃度在0～760 mg/L范圍內線性關系良好，所得方程為y=8.926×10 5x+2.658，R2=0.9999。

3.4.2 方法精密度 取植物油樣（A6）和地溝油樣（地溝油5#）各一個，均按前述方法制樣、檢測3次，A6樣平均膽固醇含量為17.7 mg/L，相對標準偏差為1.6%，地溝油5#樣平均膽固醇含量為695mg/L，相對標準偏差為1.5%。

3.4.3 方法回收率

分別稱取0.2513和0.2510 g 玉米油S2號樣品，其本底膽固醇含量為3.0 μg/g，添加了100 μL膽固醇儲備液，制樣、檢測方法同前，兩次測試結果回收率分別為103.6%和102.1%。

3.4.4 檢出限 儀器基線3倍噪音面積對應的濃度為儀器檢出限，儀器檢出限為2.9 μg/L； 同樣的樣品處理及測試條件只是不加油樣，空白的膽固醇測試結果為1.0 mg/L，所以方法檢出限為6.0 μg/g。

3.5 大樣本量SPE法分析植物油及地溝油膽固醇含量

目前，SPE法結合GC（FID）獲得的植物油膽固醇數據十分有限，為了使測定結果更具有統計學意義，選擇了84個合格植物油和13個地溝油樣，按上述方法檢測其膽固醇含量，檢測結果見表2。

表2表明，測定的84個植物油樣，其膽固醇含量都小于50 μg/g，13個地溝油樣中只有3個樣品膽固醇含量小于50 μg/g，其他都大于50 μg/g。

3.6 SPE氣相色譜法篩查植物油中地溝油

用本研究建立的SPEGC（FID）法測定7種常用植物油或由7種植物油調制的調和油膽固醇，含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油，其誤判率低（84個樣品中，誤判率為0），篩查出的樣品需用同位素內標液質聯用，或內標氣質聯用法檢測其膽固醇的準確含量或用其他地溝油檢測方法驗證，方可判定是否是地溝油或添加了地溝油，反之膽固醇含量低于50 μg/g無法得出其不是地溝油的結論。

4 結 論

膽固醇是動物油的特征甾醇，本方法采用硅膠SPE小柱（500 mg/3 mL）， 稱量0.25 g（±0.01 g），正己烷溶解，1 g無水硫酸鈉加入SPE小柱除痕量水， 正己烷活化，20 mL 5% （V/V）乙醚正己烷淋洗，20 mL 10%（V/V） 乙醚正己烷 脫，氣相色譜（FID）測定植物油膽固醇，含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油；含量低于50 μg/g不能判定不是地溝油或未添加地溝油。本方法在0～760 mg/L濃度范圍內相關系數R2=0.9999，方法檢出限為6.0 μg/g，兩個濃度水平（17.7和695 mg/L）的相對標準偏差分別為1.6%和1.5%，回收率為103%。本方法誤判率低、簡單、測試時間短且分析成本相對低，方便大量樣本分析，適合于地溝油篩查。endprint

References

1 WU HuiQin， HUANG XiaoLan， CHEN JiangHan， ZHU ZhiXin， LIN XiaoShan， HUANG Fang， MA YeFen， LUO HuiTai， DENG Xin. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31（1）： 1-6

吳惠勤， 黃曉蘭， 陳江韓， 朱志鑫， 林曉珊， 黃 芳， 馬葉芬， 羅輝泰， 鄧 欣. 分析測試學報， 2012， 31（1）： 1-6

2 YING Ying， ZHANG Jing， FENG Liang， WANG Li Yuan， ZHAO YongXin， ZHANG NianHua. Chinese Journal of Health Laboratory Technology， 2013， 23（6）： 1410-1412

應 英， 張 晶， 馮 靚， 王立媛， 趙永信， 張念華.中國衛生檢驗雜志， 2013， 23（6）： 1410-1412

3 GUO Tao， DU LeiLei， WAN Hui， HE DongPing. Food Science， 2009， 30（22）： 286-289

郭 濤， 杜蕾蕾， 萬 輝， 何東平. 食品科學， 2009 ， 30（22）： 286-289

4 XIAO HuYong， CHEN Jia， WEI GuoFen， HU QinQin， AI YongQing， HAN Yun， ZHOU XingWang， LU JianQuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 432-435

肖虎勇， 陳 佳， 魏國芬， 胡芹芹， 艾永青， 韓 韻， 周興旺， 呂鑒泉. 分析化學， 2013， 41（3）： 432-435

5 ZHOU XiLei. China Pharmaceutical Guide， 2012， 10（8）： 115-117

周希雷. 中國醫藥指南， 2012， 10 （8）： 115-117

6 XU XiuLi， REN HeLing， LI Na， ZHANG FengXia， WANG Lei， AN Juan， ZHONG WeiKe. Journal of Inspection and Quarantine， 2012， 22（2）： 16-27

許秀麗， 任荷玲， 李 娜， 張鳳霞， 王 磊， 安 娟， 仲維科. 檢驗檢疫學刊， 2012， 22 （2）： 16-27

7 ZHANG Rui ， ZU LiYa ， FAN Tie ， ZHAO KePeng. Chinese Lipid， 2006， 31（5）： 65-67

張 蕊， 祖麗亞， 樊 鐵， 趙科鵬. 中國油脂， 2006， 31 （5）： 65-67

8 Dulf F V， Unguresan M L， Vodnar D C， Socaciu C. Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj， 2010， 38： 91-97

9 VerleyenT， Forcades M， Verhe R， Dewettinck K， Huyghebaert A， De G W. JAOCS， 2002， 79： 117-122

10 Tranchida P Q， Salivo S， Franchina F A， Bonaccorsi I， Dugo P， Mondello L. Anal. Bioanal. Chem.， 2013（13）， 405： 4655-4663

11 Giacometti J. Tropical Agricultural Engineering， 2001， （4）： 28-31

Giacometti J. 熱帶農業工程， 2001， （4）： 28-31

Abstract The contents of cholesterol in a number of vegetable oils were determined by saponificationgas chromatography （FID）. There was quite a large possibility that cholesterol peak was seriously interfered by saponificationgas chromatography （FID）， so it was difficult to set a cholesterol content value to differentiate vegetable oil from waste oil. Solid phase extraction （SPE） sample pretreatment was chosen and the process conditions were optimized. The optimal conditions were as follows： 0.25 g of oil samples， 20 mL of 0.6% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （get rid of fatty acid glycerides） and 20 mL of 15% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （obtain cholesterol）. An obvious cholesterolcontentdifference between vegetable oils and waste oils was found by SPEGC. The detected cholesterol contents in 84 vegetable oil samples were all less than 50 μg/g and the contents of 11 waste oil samples among the 13 waste oils were greater than 50 μg/g. Therefore， cholesterol content in vegetable oil of more than 50 μg/g could be determined as suspected waste oil， not vice versa by SPEGC. The correlation coefficient R2 was 0.9999 in 0-760 mg/L concentration range， and the detection limit was 6.0 μg/g. Relative standard deviations at two concentration levels of 17.7 and 695 mg/L were 1.6% and 1.5% respectively. The recovery was 103%.

Keywords Waste oil； Gas chromatogray； Solid phase extraction； Vegetable oil； Cholesterolendprint