磁性粒子表面自組裝辛可寧分子印跡電致化學發光傳感器

魏小平等

摘 要 以辛可寧為模板分子、十二烷基硫醇為功能單體，在Fe3O4@Au納米粒子表面自組裝辛可寧分子印跡膜，構建了新型磁性粒子分子印跡電化學發光傳感器。通過透射電子顯微鏡對磁性納米粒子的粒徑分布及形貌進行了表征，使用紅外光譜對比分析了辛可寧、分子印跡膜洗脫前和洗脫后的結構及成分。結果表明，在最優的實驗條件下（0.012 mol/L 硼砂緩沖溶液（pH 9.5），0.8 mmol/L Ru（bpy）2+3），辛可寧濃度的對數在1 × 10 10～9 × 10 8 mol/L范圍內，與電化學發光強度變化值有良好的線性關系，檢出限為3.5×10 11 mol/L。此傳感器靈敏度高、選擇性好、易于更新，將其用于血清樣品的檢測，方法回收率為98.8%～104.7%。

關鍵詞 分子印跡傳感器； 磁性納米粒子； 辛可寧； 自組裝； 電致化學發光

1 引 言

分子印跡傳感器具有對目標分子專一識別的特性以及良好的機械穩定性和熱穩定性，近年來受到越來越多研究者的關注[1～4]。分子印跡傳感器的合成方法通常是使目標分子、功能單體以及交聯劑三者之間發生三維聚合反應，經洗脫模板分子后，留下對目標分子具有較高選擇性和親和力的識別位點。然而，傳統制備方法所得到的印跡傳感器每次使用后需要進行印跡膜的更新，繁瑣、費時，且重現性差[5～7]。

磁性Fe3O4納米粒子不僅具有諸多納米材料的優點，而且還具有超順磁效應，在外加磁場的作用下，能夠快速實現電極敏感膜的更新。利用磁性粒子作為載體， 制備易更新的分子印跡傳感器備受關注[8～10]。自組裝分子印跡技術[11]是指功能單體與模板分子之間通過非共價鍵作用（如氫鍵、靜電力、疏水作用力、范德華力等）在溶液中自發的形成單體模板分子穩定復合物的方法，它結合了分子印跡和自組裝技術的優點，已被眾多學者研究[12]。

辛可寧（Cinchonin，CCN）是一種喹啉類生物堿，具有抗心律失常、抗瘧等作用。但辛可寧使用不當，會引起人體中毒，出現頭痛、暈眩、耳鳴、惡心、視力及聽力減退等癥狀。目前對辛可寧的檢測方法也有報導[13～17]。如文獻[13]利用傳統電聚合法制備的辛可寧分子印跡膜傳感器的膜更新比較困難，且聚合物印跡膜較厚導致電子傳遞速率慢、傳感器靈敏度不高。

本研究在Fe3O4@Au磁性納米粒子表面自組裝辛可寧分子印跡膜，利用辛可寧分子與底液中Ru（bpy）2+3發生共反應以增強其電致化學發光強度的原理，采用電化學發光（ECL）的方法實現對辛可寧的測定。此磁性粒子自組裝分子印跡膜傳感器不僅檢測靈敏度較已報導的辛可寧傳感器高，而且利用自組裝方法所制備的分子印跡膜結構穩定有序，識別過程擴散阻礙少，響應快。此外，通過施加或移除外加磁場，實現電極表面的快速更新， 有效地克服了傳統印跡方法中模板分子洗脫困難的缺點。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPIE型電致化學發光分析系統（西安瑞邁分析儀器有限責任公司）； 電致化學發光采用三電極系統：工作電極為磁控玻碳電極，參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl）電極，對電極為鉑絲電極。Bransonic200 超聲儀（德國Branson Ultraschall公司）； pHS2C型精密酸度計（上海雷磁精密儀器有限公司）； GS28B電子恒速攪拌器（上海安亭電子儀器廠）； DK8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）。

辛可寧（上?；瘜W試劑站）； 三聯吡啶氯化釕六水合物（百靈威科技有限公司）； 氯金酸（國藥集團化學試劑有限公司）； 硼砂緩沖液由0.01 mol/L H3BO3和0.1 mol/L NaOH配制。實驗所用試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 磁性納米粒子Fe3O4@Au的制備

參照文獻[18]方法合成Fe3O4@Au核殼結構的納米微粒。稱取適量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，以Fe3+/Fe2+=1∶2的摩爾比混合，并溶解在水中，50 ℃恒溫水浴下高速攪拌，勻速加入適量NaOH，調節至pH 10后，升溫至80 ℃繼續攪拌1 h。整個實驗均在 N2保護下進行。制備的黑色懸浮液超聲20 min后，磁鐵分離，用水反復洗滌，定容，于4 ℃保存備用。

取0.229 g檸檬酸鈉溶解在100 mL水中，攪拌下加熱，至99 ℃時迅速加入1 mL上述制備的磁性Fe3O4納米粒子，攪拌片刻，加入5 mL 10 mmol/L氯金酸溶液，繼續加熱并攪拌15 min，移去熱源后繼續攪拌15 min，待淺棕紅色溶液冷卻到室溫后，通過外加磁場進行分離，并用水清洗后定容到20 mL，得Fe3O4@Au貯備液，4 ℃保存備用。

2.3 磁性納米粒子Fe3O4@Au表面自組裝分子印跡膜及非分子印跡膜的制備

先將適量上述Fe3O4@Au溶液加入到5 mmol/L 辛可寧乙醇溶液中，超聲振蕩10 min，室溫下靜置12 h，確保辛可寧分子通過靜電作用吸附到Fe3O4@Au納米粒子表面； 接著，向上述混合液中加入15 μL十二烷基硫醇，搖勻，室溫條件下自組裝12 h； 最后，依次用甲醇乙酸（3∶1， V/V）溶液和水洗脫模板分子，即可在Fe3O4@Au表面得到自組裝的辛可寧分子印跡膜（Molecularly imprinted membrane， MIM）。用同樣的方法制備非分子印跡膜（nMIM），只是在制備過程中不添加模板分子辛可寧。

2.4 電致化學發光檢測方法

電極在使用之前，先使用0.05 μm的Al2O3粉末研磨拋光電極表面，然后分別置于50%（V/V）HNO3、無水乙醇、水中超聲清洗，晾干備用。

移取5 μL修飾了分子印跡膜的Fe3O4@Au，滴加到磁控玻碳電極表面，以此為工作電極。電化學發光檢測是將電極置于不同濃度的辛可寧溶液中進行重吸附后，浸入到含有0.8 mmol/L三聯吡啶釕的12 mmol/L硼砂緩沖液（pH=9.5）中，直接測定發光強度。電致化學發光參數設定為： 掃描電位為0.2～1.3 V，掃描速率為100 mV/s，光電倍增管高壓為 900 V，放大級數為4級。endprint

2.5 樣品處理方法

志愿者的人體血清樣品取自桂林理工大學醫院。移取血清樣本5 mL，加入5 mL過飽和（NH4）2SO4，攪拌5 min，3000 r/min 離心10 min，除去雜質蛋白，取上清液，于4 ℃保存備用。

3 結果與討論

3.1 核殼型Fe3O4@Au磁性粒子的表征采用紅外光譜法對分子印跡膜洗脫前后進行了表征。圖2a為辛可寧的紅外譜圖，3442.30 cm 1為OH的伸縮振動峰，1637.23 cm 1為辛可寧中CN的伸縮振動峰，1112.84 cm 1為辛可寧CN的伸縮振動峰； 圖2b為分子印跡膜的紅外光譜圖，分子印跡膜中含有辛可寧的特征峰，當洗脫模板分子辛可寧后，紅外光譜中辛可寧的特征峰消失（圖2c），由此可以證明，模板分子被成功移除。

3.2 傳感器的電化學發光響應

電化學發光反應是利用辛可寧含有的叔氨基對Ru（bpy）2+3的電化學發光信號有增敏作用的原理對辛可寧進行檢測。傳感器在不同條件下的電化學發光信號見圖3。由圖3可知，修飾了分子印跡膜的電極，未洗脫模板分子時，發光強度較大（曲線a）； 而洗脫模板分子后，發光強度明顯減?。ㄇ€b）。這是由于未洗脫模板分子前，膜內含有較多的辛可寧分子，其結構中的叔氨基能夠有效增強Ru（bpy）2+3的發光強度； 而洗脫模板分子后，膜內幾乎無辛可寧分子，從而使得發光強度明顯減小。 對不同濃度的辛可寧進行重吸附，隨著吸附辛可寧量的增加，Ru（bpy）2+3的發光強度逐漸增強（曲線c和d）。

反之， 對于非分子印跡膜電極來說（見圖3插圖）。在電極表面形成一層致密的非分子印跡膜時，由于nMIM電子傳遞阻礙大，且膜內無模板分子辛可寧，不能促進Ru（bpy）2+3發光，故發光強度極?。ㄇ€e）。經洗脫處理后，發光強度幾乎不變（曲線f）?？梢娤疵撉昂髇MIM中都不存在印跡位點。

3.3 緩沖溶液的優化

分別考察了PBS、TrisHCl和硼砂3種緩沖溶液對體系ECL響應的影響。結果表明，在硼砂緩沖溶液中，傳感器的ECL響應最好。進一 步考察了不同pH硼砂緩沖液對體系ECL響應的影響。當硼砂緩沖溶液pH=9.5時，傳感器的發光效果最好，故選擇pH 9.5進行后續實驗。同時還考察了硼砂緩沖液濃度對體系ECL響應的影響。結果表明，硼砂緩沖溶液濃度為12 mmol/L時， 體系ECL響應最高。

3.4 聯吡啶釕濃度的影響

考察了Ru（bpy）2+3濃度對ECL響應強度的影響。在0.3～1.0 mmol/L范圍內，當Ru（bpy）2+3濃度較低時，發光強度很弱，其原因可能是此時參與共反應的Ru（bpy）2+3不足，導致了發光強度較低、靈敏度不高的現象； 隨著Ru（bpy）2+3濃度增加，發光強度不斷增強，但當Ru（bpy）2+3濃度過高時，電化學反應中生成的不穩定中間體Ru（bpy）3+3也較多，從而導致基線不穩， 峰形變差，所以Ru（bpy）2+3 濃度選擇為0.8 mmol/L。

3.6 分子印跡傳感器的重現性和穩定性分析

用同一支傳感器對7×10 9 mol/L辛可寧連續測定5次，電化學發光信號相對偏差為2.5%（濃度的相對標準偏差為2.6%）； 同一批次的5支傳感器對7×10 9 mol/L辛可寧進行測定，發光強度相對偏差為3.8%（濃度的相對標準偏差為3.9%），說明此傳感器有較好的重現性。為考察傳感器的穩定性，使傳感器重吸附7×10 9 mol/L辛可寧溶液后，置于4 ℃下保存，定期檢測電化學發光信號的變化。一星期內，電化學發光強度幾乎不變，兩星期之后，發光強度減少了4.7%，說明傳感器的穩定性較好。

3.7 分子印跡傳感器的特異識別性分析

為了研究傳感器的特異性識別能力，考察了辛可寧結構類似物、血清樣品中常見有機物質及常見離子對傳感器選擇性的影響。結果表明，200倍濃度的左旋咪唑； 100倍濃度的奎寧、奎寧丁、抗壞血酸、多巴胺、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸以及不同濃度倍數的常見離子（表1）對傳感器識別1×10 9 mol/L辛可寧的電化學發光響應信號變化影響小于5%，說明此傳感器對辛可寧具有較好的特異性識別能力。此傳感器敏感層的形成是將模板分子CCN通過靜電作用吸附在Fe3O4@Au表面，加入十二烷基硫醇后，通過AuS鍵自組裝在金殼表面，利用十二烷基硫醇與模板分子CCN之間的分子間作用力將印跡結構固定，洗脫模板分子CCN后，在印跡膜上留下與CCN結構及大小相互匹配的印跡位點，使得MIM對CCN產生特異性選擇識別。

3.8 樣品檢測及回收率

按照實驗方法，將傳感器置于處理好的樣品中進行重吸附，測定電化學發光信號，同時進行加標回收實驗，結果如表2所示，方法的回收率為98.8%～104.7%，相對偏差小于2.7%。

結果表明， 此傳感器制備過程簡單、易更新、靈敏度高、選擇性好，適用于血清樣品中辛可寧的檢測。

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Abstract A molecularly imprinted electrochemiluminescence sensor for detection of cinchonine based on surface selfassembly of molecularly imprinted membrane on magnetic nanoparticles was developed. Cinchonine was used as template and lauryl mercaptan was used as assembling monomer. The morphology and particle size distribution of the magnetic nanoparticles were characterized by TEM， and the infrared spectroscopy was used to study the structure and composition of cinchonine， molecularly imprinted membrane before and after elution. The results showed that， cinchonine could be specifically assayed with a linear relationship between the signal intensity and the logarithm of concentrations of cinchonine in the range of 1×10 10 mol/L to 9×10 8 mol/L. The detection limit for cinchonine was 3.5×10 11mol/L. The sensor was used for the determination of cinchonine in serum samples， with the recoveries of 98.8% to 104.7%.

Keywords Molecular imprinted sensor； Magnetic nanoparticles； Cinchonine； Selfassemble； Electrochemiluminescence

（Received 2 August 2014； accepted 28 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21165007）endprint