新型石墨烯—殼聚糖/二茂鐵衍生物/細胞色素c修飾電極的制備及其用于亞硝酸鈉的檢測研究

黃娜等

摘 要 具有共軛結構的分子導線是構筑分子電子器件的重要組成單元，而含有二茂鐵單元的該類化合物具有良好的電化學性質，被廣泛研究?；诖?，本實驗通過Sonogashira交叉偶聯等反應合成了一種新型二茂鐵乙炔衍生物（FcNH2），并經紅外（IR）、核磁共振（1H NMR和13C NMR）、質譜（MS）和循環伏安（CV）等方法表征。利用FcNH2與石墨烯殼聚糖（GHCS）之間的相互作用制備了GHCS/FcNH2復合物，并成功用于細胞色素c（Cytc）的固定，得到GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極。研究表明，GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.2 V附近出現一對峰，對應于Cytc的可逆氧化還原峰。此電極對NaNO2有良好的電催化作用，在1×107～1.5×104 mol/L范圍內，NaNO2濃度與氧化峰電流呈良好的線性關系，檢測限低至4×108 mol/L。此修飾電極不但可以實現細胞色素c的直接電化學，也可以用于定量檢測NaNO2。

關鍵詞 二茂鐵乙炔衍生物； 細胞色素c； 石墨烯； 亞硝酸鹽； 電催化

1 引 言

亞硝酸鹽是一種工業用鹽，同時也是食品添加劑[1]，起著色、防腐作用，廣泛用于熟肉類、灌腸類和罐頭等動物性食品中，但用量受到嚴格限制。亞硝酸鹽可以與胺類物質形成致癌物亞硝胺[2]。攝入過量的亞硝酸鹽可使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運輸氧的能力而引起組織缺氧性損害。由于亞硝酸鹽潛在的危害，定量分析亞硝酸鹽尤為重要。目前，定量檢測亞硝酸鹽的方法主要有電化學傳感法[3]、質譜法[4]、光譜法[2，5]、色譜法[6]、比色法[7]等。電化學方法簡單、廉價、分析迅速、檢測靈敏度和選擇性高，是相對簡單有效的方法之一。最近，許多研究者成功構建了不同的化學修飾電極，用于亞硝酸鹽的高靈敏傳感檢測[8，9]，但是發展更可靠、更靈敏的分析檢測亞硝酸鹽的電化學傳感器，仍然是近期亞硝酸鹽研究的熱點之一。

由于NO2在裸電極表面直接發生還原或氧化的電位很高，干擾物多[10]，因此，電化學檢測亞硝酸鹽的關鍵是降低亞硝酸鹽氧化還原的過電位，通常認為采用某些無機、有機或者有機金屬化合物（如鐵卟啉和酞花菁[11]等）修飾電極可以實現。二茂鐵及其衍生物是常用的小分子電子媒介體，熱穩定性好，電化學活性高，常用于構建高靈敏的化學/生物傳感器。但該類傳感器中的電子媒介體會發生部分溶解或擴散而離開電極表面導致媒介體流失，從而影響傳感器的穩定性和使用壽命。因此，如何將二茂鐵改性以獲得結構特殊的衍生物并固定于電極表面，且保持其活性和穩定性，是研究者極其關注的問題。

石墨烯（GH）是由單層碳原子通過共價鍵結合而成的具有規則六方對稱的理想二維晶體， 是繼富勒烯（C60）和碳納米管（CNT）之后的又一種碳質新材料，是構建其它維數碳質材料的基本結構單元[12]。由于石墨烯具有很大的共軛結構，可與共軛分子發生ππ堆積作用。如果將二茂鐵與一個共軛結構相連，制備一種新型二茂鐵衍生物，就可以實現二茂鐵在石墨烯材料表面的有效固定。

在修飾電極上固定細胞色素c（Cytc）或血紅素等，不但可實現它們與電極表面的電荷傳輸，同時也可用于電催化檢測過氧化氫、超氧自由基陰離子[13]、抗壞血酸和L半胱氨酸[14]等。研究表明，采用電子媒介體有助于促進Cytc與電極表面的電子轉移[15]。因此，使用一種新的電子媒介體，并采用有效的方法構建Cytc化學修飾電極，可以實現Cytc的直接電化學，同時可用于雙重放大檢測某些小分子。

基于此，本實驗合成了一種氨基封端的二茂鐵乙炔衍生物，結合石墨烯和二茂鐵的優良性質，一鍋法合成石墨烯二茂鐵乙炔胺（GHCS/FcNH2）復合物，并構建一種新型亞硝酸鹽傳感器。此二茂鐵衍生物含有苯乙炔單元、氨基和二茂鐵等基團，其中的苯乙炔基和氨基可以與石墨烯非共價或共價鍵合形成穩定的復合物，從而將二茂鐵電子媒介體固定在電極表面，不僅可以有效克服電子媒介體的泄漏，還可大大改善傳感界面上的電子傳遞。Cytc可有效固定在該復合物表面，實現其直接氧化還原，同時，制備的傳感器對NO 2具有良好的催化氧化效果，據此可建立定量檢測亞硝酸鹽的有效方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV2450型紫外分光光度計（UV，日本島津公司）、Nicolet 670 紅外光譜儀（IR，美國Nicolet公司）、F4500型熒光光譜儀（FL，日本日立公司）、Bruker500型高分辨核磁共振譜儀（CDCl3為溶劑，TMS為內標）、Nicolet 670傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片，美國尼高力公司）、掃描電子顯微鏡（Quanta200，美國FEI公司）、Hitachi600透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）。CHI 660C電化學工作站（上海CHI公司），采用三電極系統：修飾的玻碳電極、碳棒電極和飽和甘汞電極分別作為工作電極、對電極和參比電極。玻碳電極使用前先用金相砂紙拋光，再依次用1.0， 0.3和0.05 μm的A12O3懸濁液在麂皮上拋光，最后分別用HNO3 （1∶1， V/V）、無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，然后置于室溫下干燥備用。

殼聚糖（美國Sigma公司），用醋酸溶解，配制成0.5%（w/w）水溶液； Cytc （分析純，美國Sigma公司）；亞硝酸鈉（分析純，北京化學試劑有限公司）； 四氫呋喃、二異丙胺使用前均用鈉回流重蒸，進行無水處理。其它試劑均為分析純，未經任何處理直接使用。二茂鐵衍生物（FcNH2）和石墨烯均自行合成，具體合成步驟見文獻[16]。0.1 mol/L pH 7.0的 PBS（0.1 mol/L NaH2PO4 + 0.1 mol/L Na2HPO4）用超純水（經美國Milli Q 純水儀處理）配制。

2.2 實驗步驟

2.2.1 石墨烯及FcNH2的合成與表征 石墨烯氧化物由天然石墨片合成，具體步驟參見文獻[17]。主要合成步驟如下： 取500 mg天然石墨片與20 mL濃H2SO4混合， 不斷攪拌下，在15 min內加入1.75 g KMnO4。將混合物加熱至35 ℃，繼續攪拌2 h。冰浴冷卻反應液至3～4 ℃，緩慢加入23 mL去離子水，在冰水浴中攪拌反應。由溫度計監控冰水浴的溫度，確保溫度低于7 ℃。待溫度穩定后， 繼續加入270 mL水稀釋反應液。反應液以300 r/min攪拌，逐滴加入H2O2溶液除去多余的KMnO4。將反應液過濾，用10% HCl溶液洗滌，在空氣中干燥后，再真空室溫干燥24 h。水洗，并用0.2 μm的微孔尼龍網過濾后，部分還原的石墨烯氧化物再分散于75 g水中，超聲。將2 g水合肼溶于5 g水中，再加入到石墨烯氧化物的水溶液中，反應混合液保持100 ℃，并不斷攪拌，持續反應24 h。過濾，充分水洗，得石墨烯（GH）。其結構和組成經紅外、紫外、透射電子顯微鏡等表征[16]。

FcNH2的合成如圖1所示：氮氣保護下，在100 mL的單口燒瓶中依次加入126 mg （6×104 mol/L）二茂鐵乙炔（實驗室合成）[16]、131 mg （6×104 mol/L） 對碘苯胺（參考文獻[18]合成）、21 mg Pd （PPh3）2Cl2、 6 mg CuI，再加入24 mL THF和8 mL二異丙胺，攪拌溶解，于55 ℃加熱回流反應20 h，薄層色譜跟蹤反應進程，旋轉蒸發除去溶劑，殘余物用30 mL二氯甲烷溶解，水洗，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析分離純化（石油醚為洗脫劑）得153.5 mg 褐色固體，產率85%；1H NMR （CDCl3， 500 MHz） δ： 4.23 （s， 2H）， 4.25 （s， 5H）， 4.50 （s， 2H）， 6.55（s， 2H）， 7.39 （d， 2H， J=8.5 Hz）， 7.60 （d， 2H， J=8.5 Hz）； 13C NMR （CDCl3， 126 MHz） δ： 68.53， 69.91， 70.17， 71.22， 85.93， 86.44， 112.65， 114.96， 132.75， 146.77； IR （cm 1）： 3440， 3358， 2924， 2853， 2197， 1701， 1622， 1604， 1519， 1408， 1289， 1102，1027， 823；MS m/z： 301（M+， 100%）。 將產物溶于乙腈，加入高氯酸鋰作為電解質，將玻碳電極置于其中，在0.4 V附近有一對可逆的氧化還原峰，對應于二茂鐵的氧化還原[16]。

2.2.2 修飾電極的制備、表征與應用研究

將片狀殼聚糖用醋酸溶液攪拌溶解，調至pH 5.0，配成0.5%（w/w）的CS溶液，備用。將1 mg GH溶于1 mL上述CS溶液中，配成1 mg/mL的石墨烯溶液。用乙醇溶解FcNH2，配成1×10 3 mol/L溶液。取適量FcNH2溶液與石墨烯溶液，超聲混合10 min，振蕩過夜，以使石墨烯和FcNH2充分混勻，形成穩定的復合物。取適量復合物，加入Cytc的PBS溶液，振蕩混合，攪拌過夜。取適量的混合液滴于干凈的玻碳電極表面，自然風干，得GHCS/FcNH2/Cytc/GCE（具體見圖1A），備用。為對比研究，同法制備了GHCS/Cytc/GCE和GHCS/FcNH2/GCE修飾電極。

TEM， UV和IR等用于考察石墨烯及其復合物的形貌。探討不同的修飾電極在PBS中的循環伏安（CV）曲線以表征其電化學性質，并考察掃速的影響。在2×10 3 mol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6中進行電化學阻抗測試，考察修飾電極的電子傳遞性能。CV法考察不同修飾電極對NaNO2的電化學響應；對NaNO2檢測條件進行優化，并探討最優條件下修飾電極對NaNO2檢測的線性范圍。計時安培實驗在攪拌下進行，施加電壓為700 mV。實際樣品檢測操作如下：將超市購買的葡萄汁飲料經直接過濾后，稀釋10倍再采用標準加入法進行檢測。所有測試電解質溶液實驗前均通入高純氮氣除氧15 min。實驗溫度20 ℃。

3 結果與討論

3.1 修飾電極的表征

圖1A是修飾電極的制備過程。將GH先溶于CS溶液，再加入FcNH2，其與GH通過ππ堆積或者氫鍵作用等形成復合物。由TEM圖（圖1B）可知，石墨烯/FcNH2呈現清晰的片狀結構，表明石墨烯可分散在二茂鐵衍生物溶液中。

通過UV和FTIR光譜進一步確認GH與FcNH2復合物的形成，且排除殼聚糖的影響。由GH，FcNH2和GH/FcNH2的紫外光譜圖（圖2A）可知，石墨烯的紫外峰位于278 nm處，而FcNH2有兩個紫外吸收峰，分別位于260和305 nm附近。對于GH/FcNH2納米復合物，在270 nm附近出現一個紫外吸收峰。相對于石墨烯的特征吸收峰，復合物中石墨烯的峰強度有所增強，且發生一定的藍移。這些現象可能是由于石墨烯與FcNH2發生ππ堆積作用形成了復合物所致。這也可以由紅外光譜進一步證實。比較GH/FcNH2的紅外光譜圖與FcNH2和GH的紅外光譜（圖2B），復合物在2926， 1406，1082和810 cm 1處出現了二茂鐵的特征峰，同時氨基和炔鍵的峰清晰可見，分別位于3430和2218 cm 1處。另外，復合物中FcNH2的炔鍵由2210 cm 1移至2218 cm 1，氨基的位置也發生移動，表明石墨烯和FcNH2發生了作用[16]。在1635及1117 cm 1處的GH峰分別移至1620和1082 cm 1處，也證明FcNH2與GH間的ππ堆積作用。

圖3A是修飾電極在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中掃描的CV曲線。在0.7～0.3 V范圍內，裸玻碳電極和GHCS/FcNH2/GCE上都沒有任何氧化峰（若將電位范圍擴大，在0.4 V附近會出現二茂鐵的氧化峰），而GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.2 V 附近有一對氧化還原峰，對應于細胞色素c的氧化還原。這說明GHCS/FcNH2可以作為Cytc的固定基底，同時有助于實現Cytc與電極之間的電子傳遞。值得注意的是，這里的GHCS不但可以增大電極的表面積，同時能為FcNH2的固定提供結合位點。另一方面，文獻報道表明氨基可以與Cytc （pI 10）的賴氨酸殘基進一步作用，穩定地固定在電極表面[10]。因此，GH/CS/FcNH2修飾電極可為Cytc提供更多的結合位點，從而固定更多Cytc分子，同時又可以實現Cytc的直接氧化還原。

圖3B是在不同掃速下，GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中掃描的CV曲線。隨著掃速增加，氧化還原峰電流增大，同時峰電位也發生移動。在0.05～0.5 V/s內，峰電流與掃速成正比，表明固定在電極表面的 Cyt c 的氧化還原過程主要是表面控制過程。

由各種修飾電極在K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6中的Nyquist圖（圖4A）可知，裸玻碳電極的阻抗Ret約為90 Ω；而固定GHCS后，修飾電極的Ret迅速減小至15 Ω，這是由于GHCS良好的導電性使得電荷傳輸電阻減小，促進了電子傳遞。當修飾電極繼續固定上FcNH2或者Cytc后，Ret都較GHCS修飾電極大，這是由于FcNH2是一種帶有苯環的有機分子，其導電性不佳，從而在一定程度上影響電荷傳輸，而加入Cytc對電荷傳輸電阻影響很小。對于GHCS/FcNH2/Cytc/GCE，其Ret幾乎為一條直線，也表明GHCS，FcNH2和Cytc都已成功固定于電極表面，且三者協同下有利于電荷傳輸。

3.2 修飾電極對NaNO2的催化氧化

由圖5可知，當pH=7（圖5A），GH與FcNH2的質量比為5∶1（圖5B），GHCS/FcNH2復合物的體積為5 μL（圖5C）時，NaNO2的氧化峰電流最高。圖5D是在最優化條件下，GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極在不同濃度的NaNO2存在下的CV曲線。隨著NaNO2濃度增加，氧化峰電流逐漸增大，表明此修飾電極可用于NaNO2的檢測。計時安培法是常用于獲得分析物檢測線性范圍的方法，因此對檢測電位也進行了優化，發現當檢測電位為0.7 V時，響應電流最大，因此計時安培法中采用電位為0.7 V。

在最優條件下，在攪拌的PBS中不斷加入如圖6A所示濃度的NaNO2溶液時，修飾電極對NaNO2的響應非?？?，且響應電流隨濃度明顯增大，在5s內基本達到穩態電流。在此條件下，得到的濃度校正曲線如圖6B所示，由此可知，在檢測條件下，可得到兩條直線：當NaNO2濃度在0.1×10 6～5.2×10 6 mol/L和5.2×10 6～150 ×10 6 mol/L時，峰電流和濃度呈良好的線性關系，線性相關系數分別為0.992和0.996。傳感器的檢測范圍達1×10 7～1.5×10 4 mol/L，根據3倍信噪比計算出檢測限為4×10 8 mol/L， 比文獻報道基于酶傳感檢測亞硝酸的傳感器的檢測限50 nmol/L[19]或100 nmol/L [20]更優。因此，該傳感器有望用于實際樣品中NaNO2的靈敏檢測。

將制備的修飾電極用于實際樣品中NaNO2的檢測。實驗中葡萄汁樣品經過濾稀釋與PBS溶液混合后采用標準加入法檢測其中的NaNO2，結果見表1。回收率在99.1%～103.4%之間，3次測量的相對標準偏差小于3.8%，表明制備的修飾電極可以用于實際樣品中NaNO2的檢測。

綜上所述，本實驗利用設計合成的新型的二茂鐵乙炔衍生物與石墨烯結合，制備穩定的納米復合物（GHCS/FcNH2），該化合物成功作為Cytc的固定基底，不但固定了大量Cytc，同時可實現其與電極表面的直接電子傳遞。實驗表明，GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極對NaNO2有良好的電催化作用，檢測線性范圍寬，檢測限低。制備的修飾電極簡單，利用了二茂鐵和Cytc對NaNO2的催化作用，二者的協同作用使電化學催化檢測NaNO2的效果最優。因此，結合碳納米材料與電子媒介體用于固定蛋白質或其它生物分子，有望用于其它電化學/生物傳感領域的放大檢測。

References

1 Cammack R， Joannou C L， Cui X， Martinez C， Maraj S R， Hughes M N. Biochim. Bioph. Acta， 1999， 1411： 475-488

2 Ximenes M I N， Rath S， Reyes F G R. Talanta， 2000， 51： 49-58

3 Cui L， Zhu J， Meng X， Yin H， Pan X， Ai S. Sensors and Actuators B， 2012， 161（1）： 641-647

4 Pagliano E， Meija J， Mester Z. Anal. Chim. Acta， 2014， 824： 36-41

5 Dunham A J， Barkley R M， Sievers R E. Anal. Chem.， 1995， 67（1）： 220-224

6 Nilsson K F.， Lundgren M， Agvald P， Adding L C， Linnarsson D， Gustafsson L E. Biochem. Pharmacol.， 2011， 82（3）： 248-259

7 Xiao N， Yu C. Anal. Chem.， 2011， 82（9）： 3659-3663

8 Qin C， Wang W， Chen C， Bu L， Wang T， Su X， Xie Q， Yao S. Sensors and Actuators B， 2013， 181： 375-381

9 Li X R， Kong F Y， Liu J， Liang T M， Xu J J， Chen H Y. Advanced Functional Material， 2012， 22： 1981-1986

10 Welch C M， Hyde M E， Banks C E， Compton R G. Anal. Sci.， 2005， 21： 1421-1430

11 Cui L， Pu T， Liu Y， He X. Electrochim. Acta， 2013， 88： 559-564

12 Geim A K， Novoselov K S. Nature Material， 2007， 6： 183-191

13 Ding S， Wei W， Zhao G. Electrochem. Commun.， 2007， 9： 2202-2206

14 Shie J， Yogeswaran U， Chen S. Talanta， 2008， 74： 1659-1669

15 Koh W C A， Rahman M A， Choe E S， Lee D K， Shim Y B. Biosens. Bioelectron.， 2008， 23： 1374-1381

16 Liu M， Wang L， Deng J， Chen Q， Li Y， Zhang Y， Li H， Yao S. Analyst， 2012， 137（19）： 4577-4583

17 Hummers W S， Offeman R E. J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80： 1339-1339

18 Dreyse P， Isaacs M， Calfumn K， Cceres C， Aliaga A， Aguirre M J， Villagra D. Electrochim. Acta， 2011， 56（14）： 5230-5237

19 Serraa A S， Jorgea S R， Silveira C M， Mouraa J J G， Jubeteb E， Ochotecob E， Cabnerob G， Grandeb H， Almeidaa M G. Anal. Chim. Acta， 2011， 693： 41-46

20 Madasamy T， Pandiaraj M， Balamurugan M， Bhargava K， KumarSethy N， Karunakaran C. Biosens. Bioelectron.， 2014， 52： 209-215

Abstract Highly conjugated linear molecular wires are one of the basic elements for constructing molecular electronic devices. Among these conjugated compounds， ferroceneterminated compounds as well as their derivatives have been widely studied because of their ideal electrochemical activity. Based on these， a new ferroceneterminated phenylethynyaniline （FcNH2） was synthesized by Sonogashira cross coupling reaction. The structure of the target compound was identified by infrared （IR）， nuclear magnetic resonance （NMR）， mass spectra （MS） and cyclic voltammetry （CV）. Combined the graphenechitosan （GHCS） and FcNH2， a new composite of GHCS/FcNH2 was prepared and then used for immobilization of Cytc to prepare the GHCS/FcNH2/Cytc/GCE. It was found from the CV result that a pair of peaks near

0.2 V appeared which can be attributed to Cytc. The GHCS/FcNH2/Cytc modified GCE showed good catalysis towards NaNO2， and good linear relationship was found in the range of 1×10 7-1.5×10 4 mol/L，and the determination limit was bellow 4×10 8 mol/L. Therefore， cytochrome c （Cytc） can be immobilized on the GHCS/FcNH2 and the direct electron transfer can be realized between the electrode and solution and shows good prospect for detection of NaNO2.

Keywords Ferroceneterminated phenylethynyamine； Cytochrome C； Graphene， Sodium nitrite； Electrocatalysis

（Received 26 August 2014； accepted 25 December 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21305042， 21275051， 21375037）， the Science and Technology Department of Hunan Province （Nos. 14JJ4030， 13JJ2020）， and the Aid Program for Science and Technology Innovative Research Team in Higher Educational Institutions of Hunan Province. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics （2013013） and the Aid Program for Science and Technology Innovative Research Team in Higher Educational Institutions of Hunan Province.