清腸化濕方對HT-29細胞IL-6/JAK2/STAT3的影響

趙青春，沈　洪，程海波，朱　磊，李沐涵

(1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京　210046;2.江蘇省中醫院消化內科，江蘇南京　210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

?

清腸化濕方對HT-29細胞IL-6/JAK2/STAT3的影響

趙青春1，沈洪2，程海波1，朱磊2，李沐涵1

(1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京210046;2.江蘇省中醫院消化內科，江蘇南京210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1
(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

關鍵詞:清腸化濕方;潰瘍性結腸炎; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

Key words:Qingchang Huashi Recipe; ulcerative colitis; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

沈洪(1959－)，男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向:消化道疾病，通訊作者，E-mail: shenhong999@ 163.com

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種反復發作的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，發病機制尚未明確，細胞因子IL-6及其介導的信號通路在非可控性腸道炎癥過程中起關鍵作用［1］。導師沈洪教授所擬清腸化濕方(QHR)，治療輕、中度UC，取得良好效果［2］。課題組前期研究表明該方能調控UC大鼠NF-κB/COX-2通路、PPAR-γ/NF-κB及Toll通路，減少IL-1β、TNF-α等促炎因子分泌，促進抑炎因子IL-10分泌等。本實驗在此基礎上，以TNF-α、LPS共刺激誘導HT-29細胞炎癥模型，觀察清腸化濕方對IL-6及其主要信號轉導通路之一JAK2/STAT3的影響，進一步探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料HT-29，購自中國科學院細胞庫。清腸化濕方(黃連、黃芩、煨木香等購自江蘇省醫藥公司，生產批號20121201)。柳氨磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)、McCoy's5a培養基、LPS: Sigma公司;胎牛血清(Gibco公司) ; Recombinant Human TNF-α(Pepro Tech公司)。人IL-6 ELISA試劑盒(EB公司) ;引物由上海生工合成; Real Time PCR試劑盒(TaKaRa公司) ;兔抗p-JAK2、p-STAT3單抗(Cell Signaling Technology公司)。酶標儀、電泳儀、轉膜儀、Western blot曝光儀購自美國Bio-Rad公司; Real Time PCR儀(TaKaRa) ; UVP凝膠成像系統(UVP公司)。

1.2清腸化濕方水煎劑制備稱取清腸化濕方1付，共87 g，煎煮、蒸發、減壓濃縮至27 ml母液，4℃保存。

1.3實驗分組取指數生長期HT-29細胞，分?為6組:對照組:加入不含FBS的McCoy's 5a孵育24 h;模型組:根據前期研究［3］，予hTNF-α(20 μg·L－1)［4－5］孵育12 h后，再予LPS(1 mg·L－1)［5－6］孵育15 h;實驗組:根據前期研究［3］，在上述藥物干預的基礎上，分別加入SASP(2 mmol·L－1)、QHR高、中、低劑量(10、1、0.1 mg·L－1)孵育24 h。

1.4ELISA法檢測HT-29細胞上清IL-6水平收集細胞上清液，轉移至1.5 mL Eppnedorf管，離心機1 600 r·min－1離心5 min，取上清。按ELISA試劑盒步驟檢測IL-6的水平。

1.5Real Time PCR法檢測HT-29細胞JAK2、STAT3 mRNA相對表達水平取HT-29細胞，TRIzol充分裂解，氯仿萃取，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，溶于DEPC水，－80℃保存。取2μg總RNA逆轉錄為cDNA。引物: JAK2:上游5'-GGAATGGCCTGCCTTACAATG-3';下游5'-TGGCTCTATC TGCTTCACAGAAT-3'; STAT3:上游5'-CACCTTGGATTGAG AGTCAAGAC-3';下游5'-AGGAATCGGCTATATTGCTGGT-3'; GAPDH:上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3';下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。Real-time PCR反應體系: SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，DEPC水9.5 μL。反應條件: 95℃預變性2 min，95℃5 s，57℃30 s，擴增45個循環; 95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s循環讀取溶解曲線，57℃30 s讀取熒光。結果以CT值表示。

基因表達量以各樣基因CT值減去內參基因GAPDH CT值表示，相對表達量以2－ΔΔCt表示。

1.6Western blot法檢測HT-29細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達取HT-29細胞，低溫提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以30 μg質量體積分數上樣，分離膠SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉。按1∶1 000濃度稀釋一抗，4℃搖床振蕩孵育過夜，充分洗滌，按1∶3 000濃度稀釋二抗，室溫搖床振蕩孵育2 h，充分洗滌，加ECL顯影液。

1.7統計學分析實驗數據采用SPSS 19.0統計軟件進行t檢驗、One way-ANOVA分析，計量資料以±s表示。

2　結果

2.1HT-29細胞上清IL-6水平模型組細胞上清IL-6水平較對照組明顯升高(P＜0.01)，QHR各劑量組IL-6的水平較模型組降低(P＜0.01)，并呈劑量依賴性，QHR高劑量組與SASP組相比差異無統計學意義。見Tab 1。

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　IL-6/ng·L－1Control　13.07±1.43＊＊Model　98.01±2.35 SASP　32.21±1.30＊＊QHR high dose　34.60±2.22＊＊QHR middle dose　58.81±0.63＊＊QHR low dose　82.01±1.04＊＊

2.2HT-29細胞JAK2、STAT3 mRNA相對表達水平與對照組比較，各組JAK2基因表達差異倍數未見明顯差異，各組STAT3基因表達差異倍數未見明顯差異。

2.3HT-29細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達與對照組相比，模型組p-JAK2表達明顯升高(P＜0.01)，與模型組相比，各藥物組明顯降低(P＜0.01)，其中QHR各劑量組呈劑量依賴性。與對照組相比，模型組p-STAT3表達明顯升高(P＜0.01)，與模型組相比，各藥物組明顯降低(P＜0.01)，其中QHR各劑量組呈劑量依賴性。見Tab 2。

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　p-JAK2/β-actin　p-STAT3/β-actin Control　0.09±0.005＊＊　0.1±0.011＊＊Model　0.573±0.006　1.125±0.002 SASP　0.228±0.006＊＊　0.313±0.01＊＊QHR high dose　0.234±0.008＊＊　0.266±0.008＊＊QHR middle dose　0.357±0.007＊＊　0.44±0.006＊＊QHR low dose　0.42±0.005＊＊　0.764±0.003＊＊

3　討論

生理狀態下，腸上皮細胞持續暴露于腸道共生菌并能維持穩態，在炎性因子如TNF-α等作用下，腸上皮功能破壞，免疫反應失衡，導致UC發病。研究表明，在遺傳易感性IBD動物模型中Th1細胞因子和共生菌為誘導慢性炎癥所必須［6］。由于體外原代培養結腸上皮細胞的困難，目前，主要使用結腸癌細胞株進行研究。Abreu等［4］研究亦表明，HT-29細胞經TNF-α刺激后可增強對LPS的反應性，LPS信號能激活胞內多條信號通路，促進大量細胞因子和粘附分子等表達，引起瀑布式的炎癥級聯反應［7］。本實驗以前期研究為基礎［3］，以LPS與TNF-α聯合誘導HT-29細胞炎癥，結果上清中IL-6水平明顯增高，與Jeong等［5］報道一致。IL-6是一種多向性細胞因子，由活化的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能刺激巨噬細胞或單核細胞、淋巴細胞等合成前列腺素、細胞因子、血小板激活因子等炎性介質。IL-6與受體結合后優先激活JAK和STAT3，STAT3經磷酸化活化入核，調控下游靶基因轉錄，參與調節炎癥。IBD患者及一些動物結腸炎或腸炎模型中，皆觀察到升高的IL-6［8］，高水平磷酸化的STAT3與疾病嚴重程度相關［9］。本實驗表明清腸化濕方能降低LPS與TNF-α誘導的HT-29細胞IL-6的分泌，下調p-JAK2、p-STAT3水平，對JAK2、STAT3 mRNA表達水平無明顯影響，表明清腸化濕方能抑制LPS與TNF-α誘導的HT-29細胞JAK2、STAT3的活化。清腸化濕方通過降低IL-6表達，抑制JAK2、STAT3活化，阻斷炎癥的發展和持續，可能是其治療UC作用機制之一。

參考文獻:

［1］Atreya R，Neurath M F.Involvement of IL-6 in the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2005，28(3) :187－96.

［2］沈洪，張聲生，王垂杰，等.中藥分期序貫治療輕中度潰瘍性結腸炎臨床觀察［J］.中華中醫藥雜志，2012，27(7) : 1788－91.

［2］Shen H，Zhang S S，Wang C J，et al.Clinical observation of sequential stages of Chinese medicine treatment on mild to moderate ulcerative colitis［J］.China J Tradit Chin Med Pharmacy，2012，27(7) :1788－91.

［3］沈洪，劉智群，朱荃，等.清腸化濕方對潰瘍性結腸炎NF-κB/Tolls通路的影響及其機制［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33(9) :1216－20.

［3］Shen H，Liu Z Q，Zhu Q，et al.Effect of Qingchang Huashi Recipe on NF-κB/Tolls pathway in ulcerative colitis patients and mechanism study［J］.Chin J Integr Med，2013，33(9) :1216－20.

［4］Abreu M T，Arnold E T，Thomas L S，et al.TLR4 and MD-2 expression is regulated by immune-mediated signals in human iniestinal epithelial cells［J］.J Biol Chem，2002，277(23) :20431－7.

［5］Jeong J B，Shin Y K，Lee S H，et al.Anti-inflammatory activity of patchouli alcohol in RAW264.7 and HT-29 cells［J］.Food Chem Toxicol，2013，55:229－33.

［6］French N，Pettersson，S.Microbe-host interactions in the alimentary tract: the gateway to understanding inflammatory bowel disease ［J］.Gut，2000，47(2) :162－3.

［7］Herzum I，Renz H.Inflammatory markers in SIRS，sepsis and septic shock［J］.Curr Med Chem，2008，15(6) : 581－7.

［8］孫阿寧，任改艷，鄧超，等.牡荊素減輕小鼠潰瘍性結腸炎的藥效作用及機制研究［J］.中國藥理學通報，2014，30(12) : 1677－81.

［8］Sun A N，Ren G Y，Deng C，et al.Pharmacodynamic action and mechanism of Vitexin on experimental ulcerative colitis in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(12) :1677－81.

［9］Suzuki A，Hanada T，Mitsuyama K，et al.CIS3/SOCS3/SSI3 plays a negative regula?tory role in STAT3 activation and intestinal inflammation［J］.J Exp Med，2001，193(4) :471－81.

作者簡介:趙青春(1985－)，女，博士生，主治中醫師，研究方向:中醫內科消化系統疾病，E-mail: zqctim@163.com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81403344，81373606) ;國家中醫藥行業科研專項資助(No 201407001) ;國家中醫藥管理局項目(No JDZX2012079) ;江蘇省臨床醫學科技專項項目資助(No BL2014100) ;江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD) ;國家中醫臨床研究基地(脾胃)資助項目

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－26

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0883－03中國圖書分類號: R287; R329.25; R392.12; R574.621

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.029