一株吡啶降解菌的篩選及其降解性能

陳 佩，顏家保，余永登

（1. 武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081；2. 武漢科技大學 教務處，湖北 武漢 430081）

一株吡啶降解菌的篩選及其降解性能

陳 佩1，顏家保2，余永登1

（1. 武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081；2. 武漢科技大學 教務處，湖北 武漢 430081）

以吡啶為唯一碳源，從焦化廠活性污泥中分離得到一株對吡啶具有高效降解能力的菌株B1，對其進行了菌種鑒定。通過單因素實驗研究了菌株B1適宜的降解條件，對反應過程進行了動力學擬合，并考察了菌株B1對焦化廢水中吡啶的降解效果。實驗結果表明：菌株B1為革蘭氏陰性菌，屬于不動桿菌屬（Acinetobactersp.）；菌株B1適宜的降解條件為降解溫度30 ℃、初始pH 為7、搖床轉速150 r/min；菌株B1對吡啶的降解過程符合零級反應動力學模型，當初始吡啶質量濃度為300 mg/L時，降解速率常數最高達到21.103 mg/（L·h）；用菌株B1對初始吡啶質量濃度為430 mg/L的實際焦化廢水處理74 h后，吡啶降解率可達74.26%。

吡啶降解菌；菌種篩選；活性污泥；焦化廢水；動力學

吡啶是一種典型的含氮雜環化合物，普遍存在于焦化、煉油、皮革和制藥等行業的廢水中［1］。吡啶對環境的危害較大，并能影響人體的肝、腎功能，麻痹中樞神經系統，甚至致癌［2］。由于吡啶的化學性質穩定，因此廢水中的吡啶很難用傳統的生物處理法去除［3］。采用生物強化技術，向生物處理系統中投加吡啶的高效降解菌，可提高吡啶的去除效果［4-5］。國內外分離出的能降解氮雜環化合物的微生物主要有：芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［6］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［7］和副球菌屬（Paracoccussp.）［8］等。

本工作從焦化廠活性污泥中篩選得到一株以吡啶為唯一碳源的高效降解菌，對該菌進行了生理生化和16S rDNA鑒定，并就其降解特性和降解動力學進行了研究，為吡啶的生物強化處理提供了基本理論依據。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

實驗所用化學試劑均為分析純。

活性污泥：取自武漢平煤武鋼聯合焦化有限責任公司污水廠曝氣池。

焦化廢水：取自武鋼聯合焦化有限責任公司污水廠曝氣池進水，COD約為4 800 mg/L，ρ（NH3-N）約為200 mg/L，pH為6.5。

LB培養基：NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母提取物5. 0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH約為7.2。

吡啶-無機鹽培養基：K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NH4Cl 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.02 g， CaCl20.02 g， NaCl 0.1 g，微量元素儲備液2 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，pH約為7。120 ℃、0.10～0.15 MPa高壓滅菌后，加入一定量的吡啶作為唯一碳源。

平板培養基：在吡啶-無機鹽培養基中加入質量分數為1.5%～2.0%的瓊脂。

Mastercycle Gradient型PCR擴增儀：德國Eppendorf公司；1100 C型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.2 菌株篩選

取2 mL活性污泥加入到已滅菌的100 mL LB培養基中，置于30 ℃、150 r/min恒溫搖床富集培養24 h。取2 mL富集后的菌液依次轉接到100 mL 質量濃度為100，200，300，400，500，600 mg/L的吡啶-無機鹽培養基中，于30 ℃、150 r/min恒溫搖床培養10～12 h，以此來馴化吡啶降解菌。采用稀釋平板涂布法分離單菌落，再用劃線法分離純化2～3次。最后，將純化得到的菌株分別用600 mg/L的吡啶-無機鹽培養基培養，檢測各菌株對底物的降解能力，將降解能力最好的一株單菌選定為優勢菌。

1.3 菌種鑒定

將優勢菌的培養液稀釋涂布到平板培養基上，于37 ℃下培養24 h，觀察菌落形貌。按照文獻［9］報道的方法進行生理生化實驗。提取該菌株的DNA［10］，進行16S rDNA PCR擴增，委托武漢擎科創新生物科技有限公司進行測序。

1.4 優勢菌的降解特性

將優勢菌的新鮮菌液按2%（φ）的接種量接入100 mL質量濃度為300 mg/L的吡啶-無機鹽培養基中，考察降解溫度、初始pH、搖床轉速等條件對吡啶降解率的影響。

1.5 優勢菌的降解動力學

將優勢菌的新鮮菌液按3%（φ）的接種量接入不同濃度的吡啶-無機鹽培養基中，在最優條件下進行降解反應，間隔一定時間取樣，測定培養液中剩余吡啶的質量濃度，并用反應動力學模型對優勢菌的降解數據進行擬合。

1.6 實際廢水中吡啶的降解

將焦化廢水用蒸餾水稀釋至COD約為800 mg/L，添加適量吡啶，使初始吡啶質量濃度為430 mg/L。分別按以下4種方式加入優勢菌：1）不加菌液和活性污泥（空白）；2）3 mL菌液；3）3 mL活性污泥；4）3 mL菌液+3 mL活性污泥。在30℃、150 r/min的條件下，考察優勢菌對焦化廢水中吡啶的降解效果，以及菌種與污泥之間的相互作用。

1.7 分析方法

采用高效液相色譜法測定吡啶含量［11］。

2 結果與討論

2.1 優勢菌的篩選與鑒定

經過分離純化，得到7株能降解吡啶的菌株，選取其中降解效果最好的一株B1作為優勢菌，進行菌種鑒定。實驗結果表明，菌株B1為革蘭氏陰性菌，在LB培養基上菌落呈圓形，微凸，表面濕潤光滑。對菌株B1進行16S rDNA測序，將測得的基因序列用Blast軟件進行比對，數據分析結果表明，序列相關性與菌株B1達到99%甚至更高的菌種都是不動桿菌屬（Acinetobactersp.），因此可以推斷菌株B1在分子生物學上可以歸類于不動桿菌屬（Acinetobactersp.）。菌株B1的系統發育樹見圖1。

2.2 降解條件

2.2.1 降解溫度的影響

在初始pH 為7、搖床轉速160 r/min的條件下，降解溫度對剩余吡啶質量濃度的影響見圖2。由圖2可見：在降解反應開始的3 h內，不同溫度下，吡啶的降解程度差別不大，可能原因是細菌在這段時間內處于調整期，外界環境溫度的影響可以忽略不計；6 h后，菌株B1對吡啶的降解能力在不同溫度下存在明顯差異，25～30 ℃時，溫度越高，菌株B1對吡啶的降解效果越好；30～40 ℃時降解效果顯著下降，可能是由于溫度過高使得微生物體內酶的活性受到抑制，阻礙了微生物的正常代謝；因此30℃是B1的最適宜降解溫度。

圖1 菌株B1的系統發育樹

圖2 降解溫度對剩余吡啶質量濃度的影響

圖3 初始pH對剩余吡啶質量濃度的影響

2.2.2 初始pH的影響

pH太小或太大都能使微生物酶的活性喪失，影響細菌的正常生長代謝。在降解溫度30 ℃、搖床轉速160 r/min的條件下，初始pH對剩余吡啶質量濃度的影響見圖3。由圖3可見：初始pH為3和5時，吡啶的降解程度很低，說明菌株B1在酸性環境下生長受到了抑制；當初始pH為7～10時，反應18 h后，吡啶幾乎被完全降解，說明菌株B1對pH的適應力較強，在中性或堿性環境下都能存活，可能是因為吡啶在降解過程中，發生氧化反應產生了戊二酸，酸性物質中和了堿性條件下的堿性物質。因此，菌株B1降解的最適初始pH為7。

2.2.3 搖床轉速的影響

在降解溫度30 ℃、初始pH為7的條件下，搖床轉速對剩余吡啶質量濃度的影響見圖4。

圖4 搖床轉速對剩余吡啶質量濃度的影響

由圖4可見：隨降解時間的延長，不同搖床轉速時吡啶的降解效果慢慢顯露出差異；轉速過高或過低都會有礙吡啶的降解效果，轉速過低時，培養基中的溶解氧濃度降低，細菌的生長代謝放緩；搖床轉速為150 r/min和200 r/min時，吡啶的降解曲線基本重合，且吡啶質量濃度較低，這是因為搖床轉速為150 r/min時，培養基中的溶解氧基本達到飽和，再進一步增加搖床轉速也不能提高溶解氧。綜合考慮，選取150 r/min為最適搖床轉速。

2.3 菌株B1的降解動力學

不同初始質量濃度下吡啶的降解效果見圖5。由圖5可見，剩余吡啶質量濃度（ρ）與降解時間（t）的關系曲線近似為直線，說明菌株B1對吡啶的降解符合零級反應動力學方程。擬合得到的菌株B1降解吡啶的零級動力學方程見表1。由表1可見：各初始吡啶質量濃度下得到的直線方程的相關系數均大于0.9；初始吡啶質量濃度為50～300 mg/L時，隨初始吡啶質量濃度的增加，菌株B1對吡啶的降解速率常數逐步增大；當初始吡啶質量濃度為300 mg/L時，降解速率常數最大，達21.103 mg/（L·h）；當初始吡啶質量濃度大于400 mg/L時，隨初始吡啶質量濃度的增加，降解速率常數反而降低，這可能是因為底物濃度過高時，底物毒性超出了菌體承受能力范圍，阻礙了菌體對底物的降解。

圖5 不同初始質量濃度下吡啶的降解效果

表1 菌株B1降解吡啶的零級動力學方程

2.4 對焦化廢水中吡啶的降解

菌株B1對焦化廢水的處理效果見圖6。由圖6可見，在反應開始約30 h內，4種加菌方式的吡啶降解效果均不好，原因可能是焦化廢水中污染物成分多、毒性較大，菌種適應期較長；在隨后的40～54 h內，各加菌方式的降解效果逐漸拉開差距，以加菌方式4）的吡啶降解效果最好，在降解時間為54 h時剩余吡啶質量濃度即達到119.53 mg/ L。這是因為，菌株B1適應了環境，且菌株B1和活性污泥中的微生物可能經過協同效應共同代謝底物，加快了吡啶的降解。在降解時間為54～74 h時，加菌方式4）對吡啶幾乎沒有降解，這可能是因為在菌株B1和活性污泥中含有的其他菌種的協同作用下，廢水中的有機物被大量去除，造成微生物碳源不足，使得吡啶降解率沒有持續增大。在降解時間為74 h時，加菌方式2）與4）的剩余吡啶質量濃度相同，達到110.7 mg/L，吡啶降解率為74.26%，說明菌株B1在單菌作用時即對吡啶有較好的降解效果。

圖6 菌株B1對焦化廢水的處理效果

3 結論

a）以吡啶作為唯一碳源，從焦化廢水活性污泥中分離篩選得到一株吡啶降解優勢菌B1，結合菌落形態、生理生化實驗結果及16S rDNA測序對比結果，鑒定菌株B1為革蘭氏陰性不動桿菌屬（Acinetobactersp.）細菌。

b）通過單因素實驗得到菌株B1的最佳降解條件：降解溫度30 ℃，初始pH 為7，搖床轉速150 r/ min。

c）菌株B1對吡啶的降解符合零級動力學方程。當初始吡啶質量濃度為300 mg/L時，菌株B1對吡啶的降解速率常數最大，達21.103 mg/（L·h）。

d）菌株B1能在初始吡啶質量濃度為430 mg/L的實際焦化廢水中良好生長，反應74 h后的吡啶降解率達74.26%。

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（編輯 葉晶菁）

采用溶劑提取工藝將難處理煉油污泥變廢為寶

Chem Eng，2015，122（7）：7

一項采用低沸點溶劑萃取工藝的工業化項目已經開始施工，用于回收煉油廠流化催化裂化單元（FCCUs）產生的廢催化劑粉末和難處理污泥中的淤漿油。

據開發商Cat精細化管理技術有限責任公司（CFMT）稱，該工藝可使煉油廠從本將被浪費掉的廢物中分離出兩種有價物質: 可用作FCCUs平衡催化劑的粉末催化劑材料，以及可用作生產碳黑和針狀焦的優級原料的淤漿油。

當催化劑粉末（細粉）通過FCCU旋風分離器逸出并累積在淤漿油流中，形成一種被比喻為“在糖漿中的滑石粉”的污泥。該污泥被分類為環境保護局（EPA）的資源回收和保護法案（RCRA）列出的K-170危險廢棄物，并導致了“業務中最艱難的油箱清洗工作”。

目前這種污泥材料的處理方法是將淤漿油存儲罐底油泥采用光循環油（LCO）工藝稀釋，然后離心分離混合物。這種方法有缺點，因為回收的油含有大量固體污染物，而目前的方法仍然會以反洗催化劑細粉的形式產生K-170廢棄物，它們必須通過包括焚燒、填埋和水泥窯等成本高昂的方法處理。

CFMT已開發出一種可集成到淤漿油過濾系統中的工藝，可將該反洗物流處理成為可回收平衡催化劑（以干粉的形式），并100%回收與細粉混在一起的淤漿油。四部分的模塊化過程開始于消解槽，溶劑摻混物與污泥物料在其中混合并攪拌。然后，溶解的淤漿油被傾析出而殘余物經過濾分離出固體催化劑顆粒。將溶劑-濕催化劑進行干燥，溶劑從油中蒸發出來，兩者都被回收。溶劑使該材料呈現為可過濾性而無需提高溫度，因而節約了能源。

一座5 t/d的原型示范裝置已經開始建設。該裝置位于德克薩斯州SanLeon基地，不久將用于處理K-170廢棄物。該裝置于2015年7月啟動。

（以上由趙淑戰供稿）

Screening of a Pyridine-Degrading Strain and Its Biodegradation Capability

Chen Pei1，Yan Jiabao2，Yu Yongdeng1
（1. School of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China；2. Academic Administration Off ce，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

Using pyridine as sole carbon source，a high-efficient pyridine-degrading strain B1 was separated from activated sludge of coking wastewater，and was identified. The optimum degradation conditions were investigated by signal factor experiments. The reaction process was described by kinetics equations. And the degradation effect of pyridine in coking wastewater by strain B1 was examined. The experimental results show that：The strain B1 is gramnegative bacterium identif ed as gram-negativeAcinetobactersp.；The optimum degradation temperature，initial pH and stirring speed is 30 ℃，7 and 150 r/min respectively；The pyridine degradation process follows the zero-order kinetics model，and when the initial pyridine mass concentration is 300 mg/L，the degradation rate constant is up to 21.103 mg/（L·h）；After the actual coking wastewater with 430 mg/L of initial pyridine mass concentration has been treated for 74 h，the pyridine degradation rate can reach 74.26%.

pyridine；strain screening；degradation；coking wastewater；kinetics

X784

A

1006-1878（2015）06-0566-05

2015 - 07 - 16；

2015 - 07 - 30。

陳佩（1990—），女，湖北省仙桃市人，碩士生，電話 15907122564，電郵 504532896@qq.com。

湖北省自然科學基金重點項目（2011CDA054）；武漢科技大學研究生創新創業基金重點項目（JCX0006）；武漢科技大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310488009）。