雜色云芝漆酶對(duì)溴酚藍(lán)的高效降解

余昭琴，賈紅華，王婷婷，周 華，韋 萍

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

雜色云芝漆酶對(duì)溴酚藍(lán)的高效降解

余昭琴，賈紅華，王婷婷，周 華，韋 萍

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

以雜色云芝菌（Coriolus versicolor）發(fā)酵所產(chǎn)漆酶為催化劑，對(duì)溴酚藍(lán)溶液進(jìn)行脫色處理。探討了反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系pH、反應(yīng)時(shí)間、酶加入量、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度及金屬離子和小分子介質(zhì)的添加等因素對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為60 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L的條件下，溴酚藍(lán)溶液的脫色率達(dá)到94.5%；小分子物質(zhì)2，2′-連氮-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS）或金屬離子的添加對(duì)溴酚藍(lán)溶液的脫色效果沒有明顯的促進(jìn)作用。

雜色云芝菌；漆酶；溴酚藍(lán)；脫色；降解；染料廢水

染料生產(chǎn)企業(yè)排放的大量工業(yè)廢液，含有多種強(qiáng)毒性物質(zhì)，如蒽醌類、靛類和三苯甲烷類，對(duì)水體和周邊生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，嚴(yán)重威脅人類健康。三苯甲烷類染料的使用量在染料家族中僅次于偶氮類染料，難以用一般化學(xué)方法處理，也難被微生物完全礦化，尋找對(duì)該類染料的新的生物處理方法成為人們關(guān)注的問題［1］。楊秀清等［2］構(gòu)建了白腐菌Trametessp. SQ01和毛殼菌Chaetomiumsp. R01的混合培養(yǎng)體系，對(duì)三苯甲烷類染料溴酚藍(lán)進(jìn)行了脫色研究，結(jié)果表明反應(yīng)3 d后的溴酚藍(lán)降解率為94%。陳敏［3］采用木質(zhì)素降解酶液對(duì)不同染料進(jìn)行脫色，在脫色溫度30 ℃、pH=4.0、H2O2濃度5 μmol/L、混合酶液濃度20 U/mL、溴酚藍(lán)濃度25 μmol/L、脫色時(shí)間2 h的條件下，脫色率最高可達(dá)85.61%。

漆酶（laccase）是一類可降解木質(zhì)素的含銅多酚氧化酶［4］，是白腐菌胞外酶的主要組成之一［5］，具有廣泛的底物作用范圍，可以氧化降解包括單酚、鄰苯二酚和對(duì)苯二酚在內(nèi)的多種酚類化合物及其衍生物［6］，在染料降解、污水處理和多環(huán)芳香烴的降解等方面有著重要的商業(yè)價(jià)值［7-9］。目前，漆酶對(duì)三苯甲烷類染料脫色降解的研究已經(jīng)取得了較多進(jìn)展，但一般降解時(shí)間較長［2］，如唐菊［10］用漆酶處理三苯甲烷類染料，反應(yīng)24 h過程中沒有明顯的色度變化；姜曼［11］采用雞腿菇分泌的漆酶粗酶液對(duì)染料溶液進(jìn)行脫色，反應(yīng)12 h后的脫色率為78%。以上研究均存在脫色降解效率低的問題。因此，開發(fā)高效的三苯甲烷類染料的酶法脫色降解工藝顯得尤為迫切。

本工作采用本課題組前期分離得到的一株漆酶發(fā)酵產(chǎn)量高、生長速率快、易培養(yǎng)的雜色云芝菌（Coriolus versicolor）， 以該菌發(fā)酵所得的漆酶粗酶液為降解催化劑，以溴酚藍(lán)溶液脫色率為指標(biāo)，考察漆酶對(duì)三苯甲烷類染料的降解效果，為應(yīng)用漆酶處理染料廢水提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 菌種

雜色云芝菌（Coriolus versicolor）：本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁30 g，蛋白胨3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH=5.6。

種子培養(yǎng)基：麥芽汁30 g，蛋白胨3 g，蒸餾水1 000 mL，pH=5.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.25 g，羧甲基纖維素鈉15 g，酵母膏15 g，KH2PO41 g，MgSO40.25 g，L-天冬氨酸1 g，Tween-80 2 g，CuSO40.5 g，2，5-二甲基苯胺 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=4.0。

1.1.3 主要試劑

2，5-二甲基苯胺：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；2，2′-連氮-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS）：色譜純，Sigma公司；溴酚藍(lán)：天津市化學(xué)試劑研究所。其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)生化標(biāo)準(zhǔn)試劑或分析純化學(xué)試劑。

1.1.4 主要儀器

DSH2-300A型恒溫水浴搖床：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GENESYS 10S型紫外-可見分光光度計(jì)：Thermo公司。

1.2 粗酶液的制備

按文獻(xiàn)［12］報(bào)道的方法培養(yǎng)雜色云芝菌。在30 ℃搖床培養(yǎng)7 d 后，將發(fā)酵液于轉(zhuǎn)速6 000 r/ min下離心8 min，取上清液，即為漆酶粗酶液。

1.3 溴酚藍(lán)溶液的脫色反應(yīng)

用0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖液配制一定質(zhì)量濃度的溴酚藍(lán)溶液，取20 mL溴酚藍(lán)溶液于100 mL錐形瓶中，加入發(fā)酵制得的漆酶粗酶液，在攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫水浴搖床中進(jìn)行脫色反應(yīng)。分別測定反應(yīng)前后溴酚藍(lán)溶液在最大吸收波長（591 nm）處的吸光度A0和A，根據(jù)式（1）計(jì)算脫色率（η，%）［13］。測定時(shí)以HAc-NaAc緩沖液為空白。

1.4 發(fā)酵液酶濃度的測定

以ABTS為底物，按文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道的方法測定漆酶粗酶液的酶濃度。 酶活力單位（U）定義為1 mL酶液1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol ABTS 的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)溫度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

在反應(yīng)體系pH為 4.0、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為150 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為20 mg/L的條件下，反應(yīng)溫度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖1。由圖1可見，反應(yīng)溫度為20～40 ℃時(shí)，溴酚藍(lán)溶液的脫色率隨反應(yīng)溫度的升高而增大，40 ℃時(shí)脫色率達(dá)到83.1%，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)脫色率迅速減小。這是由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度過高時(shí)，酶蛋白發(fā)生變性，從而導(dǎo)致脫色率下降。因此，漆酶降解溴酚藍(lán)的較適宜反應(yīng)溫度為40 ℃。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.2 反應(yīng)體系pH對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

調(diào)整HAc-NaAc緩沖液中HAc-NaAc的配比以調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH。在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為150 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為20 mg/L的條件下，反應(yīng)體系pH對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖2。由圖2可見，漆酶在pH=4.5條件下對(duì)溴酚藍(lán)溶液的脫色率最高，達(dá)到92.2%。因此，漆酶降解溴酚藍(lán)的較適宜反應(yīng)體系pH為4.5。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、酶加入量為150 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為20 mg/L的條件下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖3。由圖3可見：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為240 min時(shí)，漆酶對(duì)溴酚藍(lán)溶液的脫色率為93.2%；反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長，脫色率增大幅度變緩。考慮到節(jié)約能耗，因此選擇漆酶降解溴酚藍(lán)的較佳反應(yīng)時(shí)間為240 min。

圖2 反應(yīng)體系pH對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.4 酶加入量對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為20 mg/L的條件下，酶加入量對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖4。由圖4可見：溴酚藍(lán)溶液的脫色率隨酶加入量的增大而增大；酶加入量為60 U/L時(shí)的脫色率高達(dá)93.7%；但當(dāng)酶加入量繼續(xù)增大時(shí)，脫色率變化不大，推測可能是因?yàn)榈孜锉伙柡停高^量所致。因此，從節(jié)約的角度考慮，60 U/L的酶加入量即可達(dá)滿意的脫色效果。

圖4 酶加入量對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.5 溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為60 U/L的條件下，溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖5。由圖5可見：溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)脫色率最大，達(dá)到 94.5%；隨溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度的增大，脫色率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明較高的底物濃度對(duì)漆酶產(chǎn)生了抑制作用。因此，較適宜的溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L。

圖5 溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.6 金屬離子種類對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

不同金屬離子對(duì)酶活力及其穩(wěn)定性的影響不同，也會(huì)影響漆酶對(duì)染料的脫色效果。在反應(yīng)體系中添加不同的濃度為l mmol/L的金屬離子，在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為60 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L的條件下考察脫色效果。以不添加金屬離子的反應(yīng)體系為對(duì)照，金屬離子種類對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見圖6。由圖6可見，金屬離子的添加對(duì)脫色效果沒有促進(jìn)作用，這是因?yàn)樵谄崦赴l(fā)酵的過程中，已經(jīng)添加了一定濃度的Cu2+來誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，故再次添加金屬離子的效果不明顯。

圖6 金屬離子種類對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.7 小分子介質(zhì)對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

為提高漆酶對(duì)溴酚藍(lán)溶液的脫色效果，分別向反應(yīng)體系中添加不同濃度的ABTS，在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為60 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L的條件下，ABTS加入量對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響見表1。由表1可見，ABTS的添加對(duì)脫色效果的影響并不大，這與文獻(xiàn)［16］報(bào)道不同，可能是由于漆酶的來源不同，導(dǎo)致其降解性能有一定的差別。

表1 ABTS加入量對(duì)溴酚藍(lán)溶液脫色率的影響

2.8 溴酚藍(lán)溶液脫色過程中吸收光譜的變化

在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、酶加入量為60 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L的條件下，分別對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間的溴酚藍(lán)溶液在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，反應(yīng)過程中溴酚藍(lán)溶液的吸收光譜圖見圖7。由圖7可見：溴酚藍(lán)溶液在最大吸收波長591 nm處的吸收峰逐漸消失，說明溴酚藍(lán)在漆酶的作用下被降解；與反應(yīng)前相比，反應(yīng)體系在200～500 nm的吸光度增大，這是加入的漆酶粗酶液的吸光度導(dǎo)致的。

圖7 反應(yīng)過程中溴酚藍(lán)溶液的吸收光譜圖

3 結(jié)論

a）以雜色云芝菌發(fā)酵所產(chǎn)漆酶為催化劑，對(duì)溴酚藍(lán)溶液進(jìn)行脫色處理。在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)體系pH為4.5、反應(yīng)時(shí)間為240 min、酶加入量為60 U/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度為40 mg/L的條件下，溴酚藍(lán)溶液的脫色率達(dá)到94.5%。該結(jié)果明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道，為生物降解三苯甲烷類染料的后續(xù)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

b）小分子ABTS或金屬離子的添加對(duì)溴酚藍(lán)溶液的脫色效果沒有明顯的促進(jìn)作用。

c）在漆酶的作用下，溴酚藍(lán)溶液在最大吸收波長處的吸收峰逐漸消失，說明漆酶對(duì)溴酚藍(lán)具有顯著降解效果。

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（編輯 葉晶菁）

·專利文摘·

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Degradation of Bromophenol Blue by Laccase from Coriolus versicolor

Yu Zhaoqin，Jia Honghua，Wang Tingting，Zhou Hua，Wei Ping
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing Jiangsu 210009，China）

The bromophenol blue solution was decolorized by using laccase fromCoriolus versicoloras catalyst. The factors affecting the decolorization of bromophenol blue solution were studied. The experimental results show that：Under the conditions of reaction temperature 40 ℃，reaction pH 4.5，reaction time 240 min，enzyme dosage 60 U/ L and bromophenol blue mass concentration 40 mg/L，the decoloration rate of bromophenol blue solution reaches 94.5%；The additions of small molecule 2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS） and metal ions have no signif cant promotion effects on decolorization of bromophenol blue solution.

Coriolus versicolor；laccase；bromophenol blue；decolorization；degradation；dye wastewater

X703

A

1006 - 1878（2015）02 - 0137 - 05

2014 - 09 - 26；

2014 - 12 - 29。

余昭琴（1989—），女，湖北省仙桃市人，碩士生，電話 15205181867，電郵 455411032@qq.com。聯(lián)系人：周華，電話 025 - 58139916，電郵 zhouhua@njtech.edu.cn。