上氣道咳嗽綜合征大鼠模型的建立與評價*

★ 曹治山史鎖芳（1.南京中醫藥大學 南京210029；2.南京中醫藥大學第一附屬醫院 南京210046）

基于已發表文獻中的造模方法均為單一的鼻竇炎模型或咽喉炎模型，本次實驗結合國內外文獻報道，選擇國內常用的SD大鼠，在傳統模型制作方法基礎上進行適當改良摸索出一種新的上氣道咳嗽綜合征模型建立方法，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠20只，由南通大學實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2008-0010）。將大鼠按體重采用隨機區組法分為2組，每組10只。分別為：（1）對照組（170.81±6.17）g；（2）模型組（170.65±5.44）g；具有可比性。

1.2 材料與儀器（1）材料：膨脹海綿：由惠州華揚醫療器械有限公司生產。批號：20101102。紅梅香煙：由紅塔煙草（集團）有限公司生產，煙氣煙堿量：0.9mg，焦油量：11mg，煙氣一氧化碳：12mg。自制風箱大小約40cm×50cm×60cm。大鼠IL-8試劑盒，美國RB公司生產，編號：BPE30583，批號：20140506BN；大鼠TNF-a試劑盒，美國RB公司生產，編號：BPE30635，批號：20140510FV。

（2）主要儀器：萊卡切片機（德國Leica公司，型號：RM2128）；熒光顯微鏡（日本制造，OLYMPUS型號：BX51）；照相機（日本制造，型號：OLYMPUS C-35AD-2）等。

1.3 造模方法 采用膨脹海綿鼻腔填塞（鼻竇炎）聯合香煙霧化（增加氣道炎癥）的方法[1-2］。先將大鼠腹腔注射麻醉后取膨脹明膠海綿片（3 mm×5 mm）置入大鼠左側鼻腔，距離前鼻孔約15 mm，位于竇口鼻道復合體處。后用1ml注射器抽取0.5mL金黃色葡萄球菌懸濁液緩慢小心注入左側鼻腔內，海綿滯留4周后，模型組大鼠，每天被動吸煙2h，連續20d。具體方法為：每天上午、下午將大鼠置于自制的風箱內，每次同時點燃3支香煙，持續約20min后，再點燃3支香煙，共自然燃燒9支香煙。6h后重復第2次吸煙。對照組以自由活動為主。采取記分法記錄抓鼻、咳嗽、噴嚏、咯痰樣次數評估鼻竇及咽喉不適程度。方法如下：（1）抓鼻、噴嚏：輕度抓鼻1分；頻繁抓鼻2分；抓鼻不止3分。（2）咳嗽：2個以內1分，3～5個2分；5個以上3分。（3）清喉：輕度咯痰樣1分；中度咯痰樣2分；咯痰樣不止3分。自香煙霧化結束后開始觀察30min，采用疊加法記分，總分超過5分視為動物造模成功。

待出現癥狀后，隨機從正常組和模型組各取2只作病理切片，模型組較正常組鼻竇組織黏膜明顯充血水腫、鼻竇、咽喉大量的炎性細胞浸潤等典型的鼻竇部病變及上氣道炎癥，視為造模成功。

1.4 一般狀況觀測 觀察實驗期間各組大鼠的呼吸頻率、精神、飲食、活動、毛發、大小便等。

1.5 標本采集與觀測

1.5.1 大鼠血樣采集 常規方法采血后用于血清各指標的檢測。

1.5.2 鼻竇部標本采集 大鼠麻醉處死后，完整切取頭部：部分直接取鼻竇部標本凍存；部分用中性甲醛固定，取鼻竇部標本石蠟包埋，行HE染色。

1.5.3 咽喉壁標本采集 大鼠麻醉處死后，沿著大鼠舌根部位，依據解剖位置固定咽喉部位，完整切取咽喉壁組織：用中性甲醛固定，取咽喉壁標本石蠟包埋，行HE染色。

1.6 統計學處理 數據用SPSS16.0統計軟件進行處理，所有數據用x-±s表示，各組間比較作t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 對照組大鼠反應正常。模型組經長時間鼻腔填塞及香煙霧吸后，出現抓鼻，鼻部不適，打噴嚏，發作性咳嗽，清嗓子，咯痰樣，易激惹，飲水量明顯增多，精神亢奮，食量減少，活動明顯增加或煩躁不安等表現。造模后，造模各組大鼠鼻竇-咽部炎癥狀累計積分平均達到5分以上，與正常對照組有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 血清中炎性介質IL-8、TNF-a水平 大鼠模型組炎性介質IL-8、TNF-a水平明顯升高，與對照組比較，P<0.03，有顯著的統計學意義。

2.3 組織病理形態學的變化（HE染色）對照組鼻竇黏膜及咽喉壁粘膜上皮完整，未見炎癥細胞浸潤；模型組：鼻竇粘膜上皮細胞中度變性（++），纖毛變性壞死脫落（++），粘膜下層大量炎細胞浸潤（+++）；咽后壁粘膜層上皮細胞中度變性、壞死、脫落（++），粘膜層及下層大量炎細胞浸潤（+++）。

2.3.1 鼻竇黏膜組織（上鼻竇為主）（已切片，HE×40）

2.3.2 咽后壁（已切片，HE×10）

對照組 模型組

3 討論

上氣道咳嗽綜合征（UACS），過去稱鼻后滴漏綜合征（PNDS），是慢性咳嗽最常見的原因之一，占持續咳嗽病因的40%~87%。隸屬于中醫學“風咳”、“久咳”范疇。眾多醫家從“風、痰、瘀、虛”等角度論治本病，但由于國內外缺乏本病動物模型的制造方法，因而中藥制劑或單味藥如何起效難以解釋。歐洲呼吸學會（ERS）將其發病原因歸咎于慢性鼻炎和鼻竇炎。而英國胸科學會（BTS）將這類導致慢性咳嗽的病因總結為“上氣道疾病”。依據2009版的《咳嗽的診斷與治療指南》[3］中對UACS/PNDS達成的共識，目前公認本病發病機制與鼻炎、鼻竇炎及氣道炎癥、氣道敏感性等因素密切相關。本次造模的方法具備下列特點：

3.1 干預因素符合本病的特點 當慢性咳嗽的患者，有鼻炎、鼻竇炎病史或者咳嗽常伴有鼻竇部位或咽喉不適癥狀，應考慮UACS的可能。實驗過程中，使用膨脹海綿填塞大鼠，而避開致敏的方法，使大鼠患上鼻竇炎，并且膨脹海綿長期滯留有利于鼻竇部位病分泌物倒流。同時觀察到大鼠有明顯抓鼻、間斷咳嗽的情況。張羅等[4］詳細闡述了導致UACS的鼻腔鼻竇疾病。亦有學者[5-6］對慢性咳嗽與鼻竇炎之間的相關性進行了探討。得出了鼻竇炎是引起慢性咳嗽的主要原因之一。其次，氣道炎癥，是引起咳嗽的重要病理基礎。短時間的煙霧刺激只是為增加氣道炎癥，而有別于與慢支、肺氣腫的造模方法。時翠芹等[7］測定了氣道炎癥在UACS中的作用，結果提示氣道炎癥可能通過增加咳嗽敏感性而在慢性咳嗽的發生中起重要作用，下呼吸道黏膜肥大細胞激活可能是連接氣道炎癥和咳嗽的一個重要環節。張巧等[8］對92例慢性咳嗽并同時有咽部癥狀和體征的患者進行病因學分析，得出“慢性咽炎”在慢性咳嗽中的重要性不應被忽視。亦有學者[9-10］通過痰誘導的方式，得出不同病因慢性咳嗽患者存在不同氣道炎癥，其中鼻后滴漏綜合征表現為中性粒細胞為主的氣道炎癥。

表1 造模前后大鼠鼻炎癥狀積分比較（x-±s，n=10）

表2 造模前后大鼠炎性介質IL-8、TNF-a水平（x-±s，n=10）

對照組 模型組

3.2 血清檢測指標及病理染色符合本病的特點 既往研究發現[11］，在非過敏性慢性咳嗽（鼻后滴漏綜合征、胃食管反流及特發性咳嗽）中，是以中性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥并伴有IL-8的表達增加。這與本實驗結果是一致的。IL-8對中性粒細胞具有強烈的趨化作用，亦能促使中性粒細胞釋放超氧化物、脫顆粒，并刺激花生四烯酸代謝產物的生成，從而導致機體局部炎癥反應，達到殺菌和細胞損傷的能力；而腫瘤壞死因子-a在鼻粘膜損傷后，主要是局部的巨噬細胞釋放TNF-a，使其濃度升高，它通過對早期炎癥滲出、炎細胞的遷移、趨化、聚集與活化等起重要作用。因而，白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-a的監測對鼻炎、鼻竇炎及氣道炎癥反應等有重要的意義[12-13］。

3.3 造模方面的不足 合格的動物模型研制是研究開發UACS新方法新制劑的基礎和必要條件，為此我們進行了初步嘗試。此次造模有機的將鼻竇病變、氣道炎癥等因素結合起來，符合上氣道咳嗽綜合征發病特點。可以初步認為此模型制作方法是有一定的推廣價值的。但我們應當看到，咳嗽致病因素非常復雜，造模過程必須排除其他導致咳嗽的可能因素；大鼠的模型和人是有差別的，大鼠難以形象的表達出其不適癥狀。本病的干預因素及研究方法有待進一步研究和深入。

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