呋喃妥因代謝物化學發光酶聯免疫檢測方法的研究

王 瑞，呂月霞，黃登宇?，王云貴，李 濤

（1.山西大學生命科學學院，太原030006；2.深圳易瑞生物技術有限公司，深圳518101；3.山西先鋒科技開發有限公司，太原030006）

呋喃妥因代謝物化學發光酶聯免疫檢測方法的研究

王 瑞1，呂月霞1，黃登宇1?，王云貴2，李 濤3

（1.山西大學生命科學學院，太原030006；2.深圳易瑞生物技術有限公司，深圳518101；3.山西先鋒科技開發有限公司，太原030006）

對呋喃妥因代謝物1－氨基乙內酰脲（AHD）進行半抗原改造，采用活化酯法將半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯為包被原，與標準品競爭AHD單克隆抗體的抗原結合位點，加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗，建立了AHD間接競爭化學發光酶聯免疫（CLEIA）檢測法，并對化學發光液、包被原與抗體最優稀釋度、包被條件、封閉液和競爭時間五項參數進行優化。結果表明：該方法具有良好的特異性，IC50為0.753 ng／mL，在雞肉組織中的檢測限為0.028 μg／kg，添加回收率在80.54%～102.64%之間，變異系數均小于10%。與國標中液相色譜－串聯質譜法（LC－MS／MS）和我國出入境行業標準中酶聯免疫檢測法（ELISA）相比，不僅降低了檢測限，而且操作簡便，為動物源性食品中呋喃妥因代謝物的殘留提供了準確、便捷的分析檢測手段。

呋喃妥因代謝物；包被原；化學發光酶聯免疫檢測

近年來，動物源性食品中獸藥殘留問題給人體帶來的毒性、致癌致畸性、耐藥性和過敏反應等危害，已引起社會各界的廣泛關注［1］。硝基呋喃類藥物對絕大多數革蘭氏菌均有抑菌殺菌作用，被廣泛應用于治療水產、畜禽等動物傳染病和胃腸道感染。但是，毒理學評價發現，硝基呋喃類藥物代謝物具有強毒性和致癌性作用［2］。因此，對硝基呋喃類藥物代謝物的分析和檢測具有重要意義。呋喃妥因是硝基呋喃類藥物之一，目前對呋喃妥因代謝物1－氨基乙內酰脲（AHD）的檢測主要是儀器分析法［3］，也有少數采用酶聯免疫（ELISA）檢測法［4－5］。化學發光酶聯免疫檢測法（CLEIA）將化學發光檢測的高靈敏度與ELISA的高特異性相結合［6］，在靈敏度和最低檢測限方面有所突破，且與儀器分析法相比，不需要昂貴的設備、操作簡單、用時短，適用于大量樣本快速篩查，對嚴把食品安全質量關有重要意義。本實驗建立了AHD CLEIA法，并對該方法進行了優化和評估。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 AHD單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗（HRP－IgG）（北京艾旗斯德科技有限公司提供）；1－氨基乙內酰脲（AHD）、二甲基甲酰胺（DMF）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N－二環己基碳二亞胺（DCC）、卵清蛋白（OVA）、魯米諾、對甲苯酚、1－（2－硝基苯亞甲基）－氨基乙內酰脲（NPAHD）、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基硅烷（TMS）（Sigma公司）；對碘苯酚、過氧化氫脲、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、對醛基苯甲酸（4－CBA）、30%雙氧水（30%H2O2）、甲醇（CH3OH）、乙醇（C2H5OH）（國藥集團化學試劑有限公司）；透析袋（Solarbio公司）；96孔化學發光板（Thermo Fisher Sicentific公司）；其他有關化學試劑均為分析純。

BSA224S電子天平（精度0.1 mg）（德國Sartorius公司）；單道微量移液器0.5～10 μL、10～100 μL（美國Thermo公司）；8通道移液器30～300 μL（德國Eppendorf公司）；1000～5000 μL移液器（大龍興創實驗儀器有限公司）；UPT－I－10T超純水機（四川優普超純科技有限公司）；VORTEX GENIUS3混勻儀、RH BASIC1加熱磁力攪拌器（德國IKA公司）；BSD－100振蕩培養箱（上海博迅實業有限公司）；SC－3610低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；UV－1600PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；INFINITE 200PRO酶標儀（瑞士Tecan公司）；AVANCE 600MHZ超導核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成半抗原1－（4－羧基苯亞甲基）－氨基乙內酰脲（CPAHD） 76.0 mg AHD溶于8.0 mL CH3OH，滴加到10.0 mL溶有75.0 mg 4－CBA的CH3OH溶液中，65℃攪拌18 h，4500 r／min離心5 min，棄上清，C2H5OH洗滌，旋轉蒸發后吹干，得白色粉末狀固體［7］。核磁共振氫譜（1HNMR）驗證CPAHD合成是否成功。

1.2.2 制備包被原CPAHD－OVA 5.0 mg CPAHD溶于 250 μL DMF，加入3.6 mg NHS和 6.8 mg DCC，室溫下反應14 h，得活化反應產物A液；取5.4 mg OVA溶于 1.3 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol／L，pH 7.4），得B液；將A液緩慢加入B液，室溫反應2 h，4℃攪拌過夜（12 h）。PBS透析96 h，4500 r／min離心5 min，棄沉淀，上清液冷凍干燥，得白色固體［7－8］。

1.2.3 AHD化學發光酶聯免疫檢測法操作步驟包被原 CPAHD－OVA用碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol／L，pH 9.6）稀釋后加入到96孔化學發光板，100 μL／well，包被一定時間；200 μL／well磷酸鹽洗滌液（PBST，0.01 mol／L，0.05%吐溫－20，pH 7.4）洗板甩干，加入200 μL／well封閉液，37℃封閉2 h，洗板；每孔加入標準品NPAHD溶液或樣品溶液50 μL和50 μL抗體，競爭反應一定時間，洗板；加稀釋4000倍的HRP－IgG，100 μL／well，37℃孵育1.5 h，洗板；加化學發光液100 μL／well，室溫下避光反應數分鐘，置于酶標儀中檢測化學發光強度RLU［9］。

1.2.4 優化CLEIA參數 影響CLEIA高靈敏度的參數很多，每個參數的改變都可能直接影響檢測結果，導致靈敏度和重復性下降。本實驗對影響較大的五項參數包括化學發光液、包被原與抗體最優稀釋度、包被條件、封閉液和競爭時間進行優化。

1.2.4.1 優化化學發光液 取44.3 mg魯米諾溶于1.0 mL DMF，配成0.25 mol／L原液；取33.0 mg對碘苯酚溶于15.0 mL DMF，配成0.01 mol／L原液；取10.8 mg對甲苯酚溶于 10.0 mL DMF，配成0.01 mol／L原液；取28.2 mg過氧化氫脲溶于1.0 mL超純水，配成0.30 mol／L原液；將30%H2O2臨用前用PBS稀釋成0.10 mol／L原液；配制1.00 mol／L， pH 8.8的Tris－HCl緩沖液作為化學發光底物緩沖液。分別配制8組不同的化學發光液組合，如表1所示。

表1 化學發光液組合

將50 μL稀釋度為1∶30000的HRP－IgG加入到化學發光板中，再加100 μL化學發光液（現用現配），每組設 5個平行，室溫下避光反應，每隔3 min測定一次RLU值，測10組，選取RLU值高且發光穩定的組別為最優化學發光液組合［10］。

1.2.4.2 優化包被原與抗體稀釋度 采用棋盤法確定包被原和抗體的最優稀釋度。將包被原按1∶1250，1∶2500，1∶5000，1∶10000，1∶20000，1∶40000的稀釋度作縱向包被，AHD單克隆抗體按1∶10000，1 ∶20000，1 ∶40000，1 ∶80000，1∶160000，1∶320000，1∶640000，1∶1280000的稀釋度作橫向包被，HRP－IgG濃度為1∶4000，競爭抑制藥物NPAHD濃度為100 ng／mL，測定化學發光強度RLU，確定最優結果。

1.2.4.3 優化包被條件 以最佳包被原稀釋濃度包被，100 μL／well，分別設置4℃包被過夜（1組）、37℃包被2 h再4℃包被過夜（2組）和37℃包被2 h（3組）3種包被條件，確定最優，每組設 3個平行。

1.2.4.4 優化封閉液 以上述最優包被原、抗體稀釋度和包被時間為基礎，分別設置1%脫脂乳粉（1組）、1%明膠（2組）和1%BSA（3組）3種不同封閉液，確定最優，每組設3個平行。

1.2.4.5 優化競爭時間 分別設置40 min、1 h、2 h、2.5 h 4組競爭時間，確定最優，每組設3個平行。

1.2.5 CLEIA方法學評估

1.2.5.1 建立CLEIA標準曲線 將標準品NPAHD配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng／mL系列濃度梯度溶液，每個濃度3個平行，按照1.2.3項步驟及上述優化后最佳實驗條件進行操作，測定RLU值。以B／B0（B為各濃度NPAHD抑制時RLU值，B0為無NPAHD抑制時RLU值）為縱坐標，NPAHD濃度的對數值為橫坐標，繪制CLEIA標準曲線，得出線性方程及該方法靈敏度IC50，其中IC50為NPAHD 50%抑制濃度。

1.2.5.2 測定特異性 CLEIA方法特異性通過交叉反應率CR來反映。將NPAHD結構類似物呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、呋喃唑酮代謝物（AOZ）、呋喃它酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（SEM）及其對應的代謝物衍生物NPAOZ、NPAMOZ、NPSEM和衍生試劑4－CBA、鄰硝基苯甲醛分別配制成 100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng／mL系列濃度，按照1.2.3項所述步驟檢測，計算其各自 IC50。交叉反應率 CR（%）＝IC50（NPAHD）／IC50（類似物）×100%。

1.2.5.3 測定準確性和精密度 CLEIA方法的準確性以回收率表示，精密度以變異系數表示。本實驗對空白雞肉樣品進行AHD標準品添加回收實驗，添加濃度分別為1、5、15 ng／g，每個濃度設5個平行，并分批進行5次實驗，計算回收率、批內變異系數及批間變異系數。

取1.0 g雞肉組織，加入4.0 mL超純水，勻漿，再加入1.00 mol／L HCl 0.5 mL和0.01 mol／L鄰硝基苯甲醛100 μL，充分混勻，置于37℃振蕩反應16 h。反應結束后，加入0.10 mol／L K2HPO45.0 mL，1.00 mol／L NaOH 0.4 mL和5.0 mL乙酸乙酯，室溫下振蕩1 min，4500 r／min離心10 min。取上清液于10 mL離心管中，45℃吹干，然后用1.5 mL正己烷溶解干燥物，再加入0.5 mL PBS溶液，室溫4500 r／min離心10 min，取底部水相用CLEIA方法測定?；厥章剩?）＝加標后實際測定值／已知加標量×100%。

1.2.5.4 測定最低檢測限 取空白雞肉樣品20份進行檢測，通過標準曲線計算對應的樣品濃度。以20份空白樣品濃度平均值（）加3倍標準差（s）作為樣品檢測的最低檢測限（LOD）。

2 結果與分析

2.1 半抗原CPAHD的鑒定 對CPAHD進行1HNMR掃描，分析圖譜可知，CPAHD，1HNMR（DMSO，20℃，δvs.TMS）4.381（s，2H，CH2），7.803－7.817（m，2H，C6H），7.862（s，1H，CH＝），8.003－8.017（m，2H，C6H），11.303－11.336（m，1H，NH），13.086（s，1H，COOH）。其中7.862（s，1H，CH＝）證明CPAHD已合成。

2.2 包被原CPAHD－OVA的紫外鑒定 參考文獻［11］對包被原CPAHD－OVA進行紫外吸收圖譜掃描，分析圖譜可知，CPAHD在299 nm處有吸收峰，OVA在 279 nm處有吸收峰，CPAHD－OVA在303 nm處有吸收峰。說明CPAHD與OVA偶聯后，吸收峰發生了明顯偏移，初步判斷包被原偶聯成功。

2.3 優化CLEIA參數

2.3.1 優化化學發光液 8組化學發光液測得RLU值如圖1，隨著時間延長，對甲苯酚作化學發光增強劑時，RLU值較對碘苯酚穩定，但RLU值卻比對碘苯酚小1個數量級左右。第2組，對碘苯酚作發光增強劑，過氧化氫脲作氧化劑，6 min內，RLU值穩定在1900000左右，滿足RLU值高且穩定的要求，故選擇第2組作為化學發光液組合，檢測時間選擇4 min。

圖1 不同化學發光液組合對應的RLU值

2.3.2 優化包被原與抗體稀釋度 競爭酶聯免疫反應中，通過考察不同反應條件下B／B0的比值，優選包被原與抗體的最適稀釋度。B／B0越小，靈敏度越高；適當增大包被原或抗體稀釋度，可提高反應靈敏度［12］。棋盤測定結果如表2，綜合考慮，選擇包被原稀釋度為 1∶10000，抗體稀釋度為1∶160000。此外，B／B0值的差異說明加入競爭抑制物NPAHD后，包被原與抗體結合反應發生了不同程度抑制，進一步證明包被原偶聯成功。

表2 不同包被原和抗體稀釋度下B／B0值

2.3.3 優化包被條件 將不同包被條件下測得結果，分別繪制標準曲線，計算IC50和RLUmax／IC50，RLUmax為最大化學發光強度。結果如圖2。第2組37℃包被2 h再4℃包被過夜的包被條件下，RLUmax／IC50最大，說明此條件下，靈敏度最高［8］。表明先在37℃條件下包被，溫度較高有助于包被原在酶標板上快速吸附，再4℃包被過夜，較長時間可使包被原包被均勻，提高靈敏度。

圖2 包被條件優化

2.3.4 優化封閉液 不同封閉液所得 IC50和RLUmax／IC50結果如圖3，脫脂乳粉和BSA的IC50接近，均低于明膠IC50，但是脫脂乳粉的RLU值偏低，以至于其RLUmax／IC50偏小，BSA RLUmax／IC50最大。說明BSA封閉時，靈敏度最高。BSA作為一種蛋白類封閉物，其降低非特異性吸附的性能優于脫脂乳粉和明膠。

2.3.5 優化競爭時間 不同競爭時間所得IC50和RLUmax／IC50結果如圖4，競爭反應1 h，RLUmax／IC50值最大，靈敏度最高，此后IC50趨于穩定，變化不明顯，RLUmax／IC50值有所降低。表明抑制物與抗體競爭性與包被原結合反應1 h后，反應基本達到穩定狀態。

圖3 封閉液優化

圖4 競爭時間優化

2.4 CLEIA方法學評估

2.4.1 建立CLEIA標準曲線 IC50是評價CLEIA方法靈敏度的重要指標，其值越小，說明此方法靈敏度越高。以優化后各參數為實驗條件，進行CLEIA系列標品濃度競爭實驗，即包被原稀釋度1∶10000，先37℃包被2 h再4℃包被過夜；以1% BSA為封閉液；抗體稀釋度1∶160000；競爭反應時間1 h；化學發光液以對碘苯酚為發光增強劑，過氧化氫脲為氧化劑，其中魯米諾、對碘苯酚和過氧化氫脲的摩爾比為5∶7∶3，加入化學發光液后避光反應4 min，測定RLU值。得標準曲線如圖5。在0.042～15.521 ng／mL范圍內，呈線性關系，可進行精確檢測，線性方程為Y＝－23.911X＋118.78，R2＝0.9917，得出IC50為0.753 ng／mL，說明本實驗建立的AHD CLEIA檢測法靈敏度較高。

圖5 AHD CLEIA標準曲線圖

2.4.2 測定特異性 CLEIA法特異性測定結果如表3，抗體除對呋喃妥因原藥存在24.80%的交叉反應外，與其他結構類似物及衍生試劑的交叉反應率均小于0.01%。由于呋喃妥因原藥在進入動物體內后，迅速代謝分解，故在實際樣本檢測中，其內并不含呋喃妥因原藥與抗體競爭性結合。說明本方法所用的AHD單克隆抗體具有良好的特異性，用于樣品檢測時，可準確測定樣品中是否有呋喃妥因代謝物。

表3 特異性測定結果表

2.4.3 測定準確性和精密度 本實驗向空白雞肉樣品組織中添加了3組不同濃度水平的AHD，通過鄰硝基苯甲醛衍生化，成為抗體識別物。CLEIA法測定各濃度水平添加回收率，每個濃度設5個平行，并分批進行5次實驗，結果如表 4，回收率在80.54%～102.64%之間，批內和批間變異系數均小于10%。說明建立的CLEIA法準確性和精密度良好，可以滿足實際樣品檢測的需求。

2.4.4 測定最低檢測限 對20份空白雞肉樣品進行檢測，通過標準曲線計算對應的樣品濃度，如表5。20份空白樣品濃度平均值為0.013 μg／kg，標準差為0.005，最低檢測限（LOD）為0.028 μg／kg。

表4 準確性和精密度測定結果表

表5 最低檢測限測定結果表

3 小結

本實驗建立了呋喃妥因代謝物AHD化學發光酶聯免疫檢測方法，并對化學發光液、包被原與抗體最優稀釋度、包被條件、封閉液和競爭時間五項參數進行了優化，該方法靈敏度IC50為0.753 ng／mL，最低檢測限達0.028 μg／kg。其最低檢測限遠低于國標［13］中液相色譜－串聯質譜法（LC－MS／MS）檢測限0.5 μg／kg和我國出入境行業標準［14］中ELISA法檢測限0.1 μg／kg，因而更加符合動物源性食品中AHD不得檢出的高靈敏度檢測要求［15］，對于嚴格監控AHD殘留、嚴把食品安全質量關、保障食品安全具有重要參考價值。此方法精密度、準確性和特異性良好，是下一步研制AHD化學發光酶聯免疫快速檢測試劑盒的基礎，以滿足大批量樣本快速篩查的需求，為基層食品安全監管人員檢測AHD殘留量提供一種準確、可靠、便捷的方法，有利于迅速控制食品安全風險，保障人民群眾飲食健康安全。

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［14］國家質量監督檢驗總局SN／T 3380－2012.出口動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定 酶聯免疫吸附法［S］.

［15］中華人民共和國農業部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量［Z］.

（編 輯：侯向輝）

Study of Chemiluminescent Enzyme Immunoassay Method for Nitrofurantoin Metabolite

WANG Rui1，LV Yue－xia1，HUANG Deng－yu1?，WANG Yun－gui2，LI Tao3
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan030006，China；2.Shenzhen Bioeasy Technology Inc.，Shenzhen518101，China；3.Shanxi Vanguard Technology Co Ltd.，Taiyuan030006，China）

The haptene of nitrofurantoin metabolite（AHD）was modified by hapten，then made it conjugate with ovalbmin（OVA） by using N－hyduoxysuccinimide ester method to synthesize envelope antigen.Then the compound was coupled to AHD monoclonal antibody competitively with standard reference.After the HRP labeled goat－anti－mouse secondary antibody coupled to the monoclonal antibody which conjugated with envelope antigen，an indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay（CLEIA）for AHD was established.Then five test parameters，such as chemiluminescent solution，envelope antigen concentration and antibody concentration，enveloped condition，sealed liquid and competitive reaction time were optimized.The results indicated that the AHD CLEIA had good specificity for AHD.We obtained an IC50value of 0.753 ng／mL.We also obtained the limit of detection of 0.028 μg／kg and recoveries rates of AHD ranged from 80.54%to 102.64%in spiked chicken samples.The coefficient of variation was less than 10%.Compared with LC－MS／MS in national standards and ELISA in industry standard for CIQ，this method not only improved the detection limit，but also operated easily.It could provide a convenient and accurate way for detection of AHD，which will have great value for the evaluation of food safety.

nitrofurantoin metabolite；envelope antigen；CLEIA

2015－02－10

A

1002－1280（2015）04－0035－07

S859.79

王 瑞，碩士研究生，從事食品質量安全檢測研究。

黃登宇。E－mail：Huangdy110＠126.com