高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定鄰苯二甲酸酯色譜條件優(yōu)化

沈小明，時 磊，呂愛娟，沈加林，胡璟珂，蔡小虎，代靜玉

1．南京地質(zhì)礦產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210016

2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)又稱酞酸酯，作為一種主要的增塑劑被廣泛地應(yīng)用于塑料生產(chǎn)工業(yè)中。已有資料表明，全球PAEs的年產(chǎn)量可達(dá)500萬 t，中國每年用于PVC加工制造的增塑劑已經(jīng)超過100萬 t，其中PAEs用量可占到90%左右［1-2］。由于PAEs與塑料產(chǎn)品的基質(zhì)之間不以化學(xué)鍵相結(jié)合并且彼此化學(xué)性質(zhì)相對獨(dú)立，在使用過程中PAEs會從塑料制品中不斷遷移、浸出并釋放到空氣、水體、土壤和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中。PAEs是一類典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，有明顯的“三致”作用和生殖毒性［3-4］。美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)將6種PAEs物質(zhì)，鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)列入優(yōu)先控制有毒污染物名錄，中國也將 DMP、DEP、DnOP 3種化合物確定為優(yōu)先控制的環(huán)境有機(jī)污染物［5］。

諸多研究報道了帶氫火焰檢測器(FID)或電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜法(GC)［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)［8］、帶紫外檢測器(UV)或二極管陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜法(HPLC)［9］、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)［10-11］等不同種類儀器用于PAEs的分析測定。由于PAEs類物質(zhì)具有較高的沸點(diǎn)，應(yīng)用GC或GC-MS測定時對氣化溫度、柱溫具有較高要求，相比較而言，HPLC適用范圍更為廣泛，可用于大多數(shù)有機(jī)化合物的分析。二極管陣列檢測器與普通的紫外檢測器相比，可做隨峰掃描，同時可獲得三維色譜-光譜圖，并根據(jù)色譜的保留時間、光譜信息提高定性的可信度［12］。因此，本文建立并研究了應(yīng)用HPLC-DAD測定6種EPA優(yōu)先控制PAEs過程中的各種影響因素，優(yōu)化了相關(guān)色譜條件，從而為快速、準(zhǔn)確地測試實(shí)際樣品提供分析依據(jù)和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國):配二極管陣列檢測器。

分析天平(0.1 mg感量，AL104，美國)，氣密性進(jìn)樣針(100 μL、1 mL，瑞士)，WH-3 漩渦振蕩儀(中國)，Milli-Q A10純水儀(美國)。

A級容量瓶:(50±0.06)mL、(10±0.04)mL，棕色。

6種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單標(biāo)(德國Dr．Ehrenstorfer公司)。分別為DMP單標(biāo)(0.5 g，純度 99.5%)，DEP 單標(biāo)(0.5 g，純度 99.5%)，BBP單標(biāo)(0.25 g，純度 99.5%)，DBP 單標(biāo)(0.5 g，純度99.0%)，DEHP 單標(biāo)(0.5 g，純度 99.0%)，DnOP 單標(biāo)(0.25 g，純度99.0%)。

甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，超純水(18 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

在25℃室溫環(huán)境下，將裝有一定量甲醇溶劑的50 mL棕色容量瓶置于分析天平上，去皮后，用氣密性進(jìn)樣針移入適量的PAEs單標(biāo)，準(zhǔn)確記錄讀數(shù)，再用甲醇定容至刻度，于漩渦振蕩儀上振蕩均勻，得到各單標(biāo)儲備溶液(DMP、DEP、BBP、DBP、DEHP、DnOP)的濃度分別為 9 000、9 000、4 000、9 000、9 000、4 000 mg/L。分別移取上述6種單標(biāo)儲備溶液各1 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為900 mg/L的DMP、DEP、DBP、DEHP 和濃度為 400 mg/L 的BBP、DnOP混和標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于4℃冷藏柜中避光保存。實(shí)際測定時，先將PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液取出平衡至25℃，再將其稀釋為4.5～180、2～80 mg/L濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱:SupelcosilTMLC色譜柱(15 cm×4.6 mm，0.5 μm)。流動相:乙腈和水，根據(jù)條件實(shí)驗(yàn)設(shè)定梯度洗脫比例分別為 100∶0、80∶20、60∶40、50∶50，設(shè)定流速分別為 0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量 15 μL。

DAD檢測器掃描波長范圍為190～400 nm，帶寬2 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同梯度洗脫和流速下PAEs的色譜響應(yīng)

每一實(shí)驗(yàn)條件下獲得的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)譜圖均與同一條件下各單標(biāo)的譜圖對比，以保留時間來確保定性的準(zhǔn)確性。流速恒定條件下，當(dāng)流動相為純乙腈時，僅DEHP、DnOP兩種物質(zhì)能夠達(dá)到基線分離，為了減少分析時間，后續(xù)梯度實(shí)驗(yàn)均將DEHP、DnOP兩種物質(zhì)出峰時的流動相調(diào)節(jié)為100%乙腈。流動相比例的變化，改變了色譜梯度洗脫的強(qiáng)度，進(jìn)而影響了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分離效果，但不會對6種PAEs的出峰順序產(chǎn)生影響。隨著流動相中水的比例越來越大，其余4種PAEs也逐漸分離開來。當(dāng)流動相乙腈-水的體積比為50∶50時，6種PAEs物質(zhì)均能達(dá)到基線分離，其出峰順序依次為 DMP、DEP、BBP、DBP、DEHP、DnOP，且各色譜峰峰形對稱、尖銳，滿足后續(xù)定量分析的要求。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)定 DMP、DEP、BBP、DBP出峰時流動相乙腈-水梯度比例為 50∶50，DEHP、DnOP 出峰時流動相調(diào)整為100%乙腈。

在流動相比例確定的條件下，考察了不同流速條件對PAEs各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜響應(yīng)的影響，見表1。

表1 不同流速下6種PAEs的色譜響應(yīng)

結(jié)果表明，流速對PAEs各物質(zhì)的出峰時間、峰高和峰面積均有較大的影響。隨著流速的增加，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰的保留時間均隨之縮短，DMP保留時間由4.84 min變?yōu)?.43 min，減少近一半。最后出峰的DnOP保留時間由16.49 min減少為12.49 min。可見流速增加的情況下，目標(biāo)物質(zhì)出峰時間大大提前，可以為大批量實(shí)際樣品的分析和測定節(jié)約時間。

但在流速增大的同時，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜響應(yīng)也在減弱，流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min情況下的PAEs各物質(zhì)的峰面積分別僅占流速0.6 mL/min的74.6% ～75.0%、56.0% ～60.7%、48.9%～49.7%。這是因?yàn)槎O管陣列檢測器作為一種濃度型檢測器，當(dāng)進(jìn)樣量一定時，各目標(biāo)化合物的峰面積與流速成反比關(guān)系，且峰面積與流速的乘積為一常數(shù)。各物質(zhì)峰高分別占流速0.6 mL/min的78.6% ～92.7%、67.0% ～88.1%、58.5% ～82.4%。

由于實(shí)際環(huán)境樣品中PAEs大多處于痕量污染水平，綜合考慮樣品測試效率、分析精度及實(shí)際樣品中存在雜質(zhì)干擾等因素，選擇響應(yīng)較高，同時出峰時間較短的流速0.8 mL/min作為最終色譜分析的流速條件。在流速確定的前提下，梯度洗脫的最終條件設(shè)定為洗脫0～11 min，流動相乙腈-水梯度比例為50∶50，11 min后流動相調(diào)整為100%乙腈。

2.2 波長的選定及對PAEs測定的影響

二極管陣列檢測器可以記錄目標(biāo)化合物在一定波長范圍內(nèi)的吸光度，同時獲得不同波長下的光譜圖。利用DAD檢測器對6種PAEs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行波長(190～400 nm)掃描，其特征吸收波長見圖1。

圖1 PAEs的特征波長

從圖1可以看出，6種PAEs物質(zhì)的紫外吸收譜圖差別不大，每種化合物均有3個特征吸收波長，分別為 200、225、275 nm。在波長為 200 nm時，吸收強(qiáng)度最大，但是該波長處干擾雜質(zhì)較多且作為流動相的乙腈也存在紫外吸收，進(jìn)而影響了目標(biāo)化合物的測定。

在上述確定的流動相比例及流速條件下，分別對225、275 nm兩個波長下同一濃度的PAEs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，見圖2。

圖2 不同波長下PAEs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

從圖2可以看出，兩個波長下PAEs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜響應(yīng)存在明顯差異，225 nm波長下的色譜峰均大于275 nm。因此，研究確定PAEs的測定波長為225 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)“1.2節(jié)”的描述配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在優(yōu)化的色譜條件下采用外標(biāo)法定量。以各PAEs化合物的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。表2結(jié)果表明，在所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，6種PAEs的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 80，完全滿足實(shí)際樣品的定量分析要求。

表2 PAEs校準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 儀器檢出限和方法精密度

圖3 PAEs儀器檢出限示意圖

儀器檢出限是儀器在一定置信度內(nèi)目標(biāo)化合物檢測信號與噪聲信號有明顯差異時所對應(yīng)的量，是反映儀器靈敏度的一項(xiàng)重要指標(biāo)［13］。一般在儀器運(yùn)行穩(wěn)定的前提下，對配制好的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測，將所得化合物的峰高(S)與噪聲峰高(N)進(jìn)行比較，當(dāng)S/N大于3時，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋，直到S/N等于或略小于3，此時的濃度即為該化合物的儀器檢出限。PAEs的儀器檢出限見圖3。

Agilent 1100液相色譜工作站數(shù)據(jù)分析模塊中，在選定儀器噪聲時間段的前提下，會自動計算目標(biāo)化合物的儀器檢出限。根據(jù)上述的測定流程，6種PAEs的儀器檢出限結(jié)果見表3。

從表3中可知，6種PAEs物質(zhì)的儀器檢出限范圍為0.08～0.12 mg/L，考慮到實(shí)際進(jìn)樣體積為15 μL，則6 種PAE 的最小檢測量［10］(MDA)范圍為1.2～1.8 ng。本方法儀器檢出限低于鐘嶷盛等［14］用GC-FID測定公園水體中鄰苯二甲酸酯的檢出限0.40～4.58 mg/L，與張小輝等［15］報道的GC-MS法測定土壤中PAEs檢出限較為接近(MDA 為 1.005 ng)，高于李紅等［16］用 GC-MS/MS測定土壤中PAEs的檢出限(MDA為1～5 pg)。本方法靈敏度較高，適合土壤等鄰苯二甲酸酯含量較高的基質(zhì)樣品的快速分析測定。

表3 6種PAEs的儀器檢出限

在優(yōu)化的色譜條件下，對同一濃度PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行6次連續(xù)測定，計算每種目標(biāo)化合物保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表4。保留時間的RSD范圍為0.02% ～0.06%，峰面積的RSD范圍為0.13% ～0.86%，該方法對6種PAEs的測定具有良好的精密度。

表4HPLC-DAD測定PAEs方法精密度

3 實(shí)際土壤樣品分析

稱取5.0 g土壤樣品于具塞三角玻璃瓶中，加入40 ml正己烷-二氯甲烷混合溶劑(兩者所占比例均為50%)，浸泡過夜。于25℃水浴中超聲20 min，重復(fù)2次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積，轉(zhuǎn)移至SPE硅膠柱凈化，用10 ml丙酮-正己烷混合溶劑(其中丙酮所占比例為10%，正乙烷所占比例為90%)洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮，乙腈定容至1 ml。

利用最終優(yōu)化的HPLC-DAD色譜條件對實(shí)際土壤樣品提取液進(jìn)行測定，實(shí)際土壤樣品中6種PAFs分析結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際土壤樣品中6種PAEs分析結(jié)果 μg/g

從表5中可以看出，土壤中DMP、DEP、DEHP普遍檢出，其含量分別為0.43～1.68、0.21～0.96、0.11 ～3.12 μg/g。該方法對實(shí)際土壤樣品中優(yōu)控PAEs的分析具有較好的適應(yīng)性。

4 結(jié)論

在優(yōu)化梯度洗脫、流速、檢測波長等色譜條件參數(shù)的基礎(chǔ)上，建立了HPLC-DAD測定6種鄰苯二甲酸酯的分析方法。鄰苯二甲酸酯DAD檢測最佳波長為225 nm，以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，各化合物均能完全分離，優(yōu)化后的流速為0.8 mL/min。利用該方法對實(shí)際土壤樣品的分析測定也取得了比較滿意的結(jié)果。該方法操作簡便、分析時間短，具有較好的精密度及較高的靈敏度，適用于批量樣品的快速分析測定，對于較高沸點(diǎn)疏水性有機(jī)化合物的HPLC-DAD測定方法的優(yōu)化和確立有一定借鑒意義。

由于該方法僅針對6種優(yōu)控鄰苯二甲酸酯進(jìn)行測定，其他PAEs化合物是否適合仍需論證。此外，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對基體復(fù)雜、干擾物更多的生物等環(huán)境樣品中PAEs分離和測定研究。

［1］Sun J Q，Huang J，Zhang A P，et al．Occurrence of phthalate esters in sediments in Qiantang River，China and inference with urbanization and river flow regime［J］．Journal of Hazardous Materials，2013，248/249:142-149．

［2］Guo Y，Kannan K．Comparative assessment of human exposure to phthalate esters from house dust in China and the United States［J］．Environmental Science ＆Technology，2011，45:3 788-3 794．

［3］趙勝利，楊國義，張?zhí)毂颍龋槿浅鞘腥旱湫统鞘型寥类彵蕉姿狨ノ廴咎卣鳎跩］．生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2009，18(1):128-133．

［4］Zhu J P，Susan P P，F(xiàn)eng Y L，et al．Phthalate esters in human milk:Concentration variations overa 6-month postpartum time［J］．Environmental Science ＆Technology，2006，40:5 276-5 281．

［5］蔣麗佳，許秋瑾，梁存珍，等．江蘇某縣地下水鄰苯二甲酸酯類的檢測與風(fēng)險評價［J］．中國環(huán)境監(jiān)測，2013，29(4):5-10．

［6］Liu H，Liang H C，Liang Y，et al．Distribution of phthalate esters in alluvial sediment:A case study at JiangHan Plain，Central China［J］．Chemosphere，2010，78:382-388．

［7］陳海東，鮮啟鳴，鄒惠仙，等．超聲萃取氣相色譜法測定植物樣品中鄰苯二甲酸酯［J］．環(huán)境化學(xué)，2006，25(2):228-231．

［8］Del C M，Alessia P，Giampiero S，et al．Determination of phthalate esters in wine using solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］．Food Chemistry，2008，111:771-777．

［9］Liang P，Xu J，Li Q．Application of dispersive liquidliquid microextration and high-performance liquid chromatography for the determination of three phthalate esters in water samples［J］．Analytica Chimica Acta，2008，609:53-58．

［10］L ópez-Jiménez F J， Rubio S， Pérez-Bendito D．Determination ofphthalate estersin sewage by hemimicelles-based solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry［J］．Analytica Chimica Acta，2005，551:142-149．

［11］黃珂，趙東豪，黎智廣，等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中鄰苯二甲酸酯［J］．海洋環(huán)境科學(xué)，2011，30(4):590-593．

［12］劉寶，周莉莉，王駿，等．基于二極管陣列檢測器的色譜峰純度的快速直觀鑒定［J］．光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(4):1 684-1 689．

［13］冉敬，杜谷，楊樂山，等．關(guān)于檢出限的定義及分類的探討［J］．巖礦測試，2008，27(2):155-157．

［14］鐘嶷盛，陳莎，曹瑩，等．北京公園水體中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的測定及其分布特征［J］．中國環(huán)境監(jiān)測，2010，26(3):60-64．

［15］張小輝，王曉雁．氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定土壤中鄰苯二甲酸酯類增塑劑［J］．巖礦測試，2010，29(5):531-534．

［16］李紅，田福林，任雪冬，等．氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中的鄰苯二甲酸酯［J］．色譜，2011，29(6):563-566．