響應面法優化龍膽苦苷的純化工藝

向志蕓，李小芳，羅開沛，羅 佳，林 浩，嚴敏嘉

(成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

?

響應面法優化龍膽苦苷的純化工藝

向志蕓，李小芳*，羅開沛，羅 佳，林 浩，嚴敏嘉

(成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

目的：應用響應面法優選龍膽苦苷的大孔樹脂純化工藝。方法：通過預實驗和單因素試驗，根據星點設計-響應面法設計原理，采用三因素五水平響應面分析方法，以龍膽苦苷的轉移率和龍膽苦苷的百分含量為考察指標，對上柱液濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量進行優化，最終確定龍膽苦苷的大孔樹脂純化工藝。結果：采用HPD-100型大孔樹脂，最佳純化工藝為：上柱液質量濃度為0.2g/mL,乙醇濃度為30%，乙醇用量為5BV，龍膽苦苷的百分含量可達到73.4%。結論：星點設計-響應面法優化龍膽中龍膽苦苷的純化工藝效率高、方法簡便、預測性好，可用于實驗室小量制備，為擴大再生產提供參考。

龍膽；龍膽苦苷；星點設計-效應面法；大孔樹脂；純化工藝

龍膽(Gentianachinensis)為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag)、龍膽(Gentian.ascabraBge.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall. )或滇龍膽(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根莖,前三種習稱“龍膽”，后一種習稱“堅龍膽”，具有清熱、瀉肝、定驚之功效。據《現代本草綱目》[1]記載，因其葉如龍葵，味苦如膽，因此而得名。化學成分研究表明，龍膽苦苷(gentiopicroside，GTP)是龍膽科植物龍膽、秦艽等活性最強的有效成分之一[2]。現代藥理研究表明，龍膽苦苷對多種肝損傷具有顯著的保護作用，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮痛作用，具有非常重要的開發價值[3]。龍膽苦苷已獲得SFDA新藥證書。為更好地開發利用它，本實驗進行了龍膽苦苷的最佳純化工藝研究，以期使龍膽苦苷得到進一步開發和有效利用。

1 儀器與試藥

UV-6100型紫外可見分光光度計，PS-60A型超聲波清洗器，BP-61 電子天平，Q-250B3型高速多功能粉碎機,龍膽飲片購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司(批號:1111044，產地:云南)，粉碎至粗粉，備用。龍膽苦苷對照品購于成都曼思特生物科技有限公司(批號:MUST-14081205)，D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300型大孔樹脂( 滄州寶恩吸附材料科技有限公司) ，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 龍膽上柱液的制備

準確稱取龍膽藥材10g,60%乙醇加熱回流提取3次，第1次2h，第2次1h，第3次1h,溶劑用量為12倍。合并3次提取液，減壓回收溶劑，濃縮后離心，加入適量水，制得一定濃度的龍膽上柱液。

2.2 龍膽苦苷含量測定方法

2.2.1 最大吸收波長的確定 分別取不同濃度的對照品溶液和樣品溶液在200～800nm作紫外掃描，確定最大吸收波長為274nm。

2.2.2 對照品溶液配制及標準曲線繪制 精密稱取0.003 28g溶液置25mL棕色容量瓶中，先用10mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容于至刻度，搖勻，即得。精密吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL于容量瓶中，得龍膽苦苷濃度為6.56g/mL、13.12g/mL、19.6g/mL、26.24g/mL、32.8g/mL、39.36g/mL的溶液，以70%乙醇稀釋至刻度，用紫外分光光度計在274nm處，以70%乙醇為隨行空白，測定吸光度，所得結果以龍膽苦苷溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標作線性回歸，得回歸方程為A=0.019 2C+0.011 4，(r=0.999 1)，對照品濃度在13.12～39.36μg/mL范圍內線性關系良好。實驗所需進行含量分析的樣品，均采用以上回歸方程進行線性回歸計算，得含量測定結果。

2.3 龍膽苦苷純化工藝優選

2.3.1 單因素實驗 ①靜態-吸附解析試驗篩選樹脂型號。準確稱取5種經預處理的干樹脂(D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300)各4g于100mL具塞磨口錐形瓶中，分別加入20mL的龍膽上柱液(按龍膽藥材計為0.10g·mL-1)，放置24h并適當振搖，濾過，取上清液測定龍膽苦苷的質量濃度，計算樹脂的吸附量和吸附率。將已吸附飽和的不同樹脂置于100mL具塞磨口錐形瓶中，分別加20mL 30%乙醇振蕩24h進行靜態洗脫，測定洗脫液中龍膽苦苷的質量濃度，計算洗脫率。以樹脂吸附量、吸附率和洗脫率為評價指標，篩選出最佳樹脂。結果顯示，HPD-100型樹脂對龍膽苦苷的吸附-洗脫性能最佳。②上柱液濃度對樹脂吸附效果的影響。分別取10mL藥材質量濃度為0.05g/mL,0.1g/mL,0.2g/mL,0.3g/mL,0.5g/mL的龍膽上柱液，上于15mL HPD-100大孔樹脂柱，以2BV/h的流速通過大孔樹脂，分別測定流出液中GTP的質量濃度，并計算GTP的吸附量和吸附率。結果顯示，選擇上樣藥材質量濃度為0.3g/mL較適宜。③HPD-100型樹脂對龍膽苦苷動態吸附性能的考察。將藥材質量濃度為0.3g/mL的上柱液加于裝有15mLHPD-100型樹脂的樹脂柱上，控制流速為2BV/h，每4mL收集一份流出液，測定各流出液中龍膽苦苷的質量濃度，繪制動態吸附泄露曲線，橫坐標為流出液體積(mL),縱坐標為龍膽苦苷的吸附量(mg/mL)。結果顯示：15mL樹脂泄露前流出液的體積為4mL。此時樹脂床共吸附GTP 92mg，濕態HPD100樹脂對GTP的工作吸附量(泄漏前吸附量)可達6.13mg/mL。④上柱流速對吸附的影響。取10mL藥材質量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液4份，分別加于裝有15mL HPD-100型樹脂的樹脂柱上，上柱液分別以1BV/h、1.5BV/h、2BV/h、3BV/h的流速通過HPD-100樹脂柱，收集流出液，測定流出液中GTP濃度，計算吸附率。結果顯示：當流速為3BV/h時，吸附率達到最高(96.3%)。⑤洗脫劑的確定。取10mL藥材質量濃度為0.3g/mL龍膽上柱液5份，分別加于裝有15mL HPD-100型樹脂的樹脂柱上，控制上柱流速和洗脫流速均為3BV/h,待吸附完全后，用3BV的去離子水洗去樹脂表面或內部殘留的多糖、無機鹽等水溶性雜質，分別用4BV的10%、20%、30%、40%、50%的乙醇液進行洗脫，測定各流出液中GTP的含量，計算洗脫率。結果顯示20%乙醇的洗脫率可達到80%，隨乙醇濃度增加，洗脫率在增大，當乙醇濃度達到40%時，洗脫率達到最大(85%)，故洗脫劑濃度在20%～40%均可。⑥洗脫劑用量考察。取10mL藥材質量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液上于HPD-100型樹脂柱，控制上柱流速為3BV/h,待吸附完全后，用3BV去離子水洗滌樹脂，用30%乙醇洗脫液洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，每1BV收集一份流出液，測定流出液中龍膽苦苷的質量濃度。結果顯示：當洗脫液體積達到5BV時，能基本洗脫完全，所以，初步確定洗脫液用量為5BV。⑦洗脫流速的確定。取10mL藥材質量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液上于HPD-100型樹脂柱，流速為3BV/h，待吸附完全后，用3BV的蒸餾水洗脫，再用5BV 30%乙醇分別以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速進行洗脫，測定30%乙醇洗脫液中GTP的質量濃度，計算GTP的洗脫率。結果顯示：當洗脫流速3BV/h時，洗脫率最高。

2.3.2 星點設計-效應面試驗與結果 在以上單因素試驗基礎上，根據星點設計-響應面法試驗設計原理選擇對龍膽苦苷純化影響較大的三個因素即上柱液濃度、乙醇濃度、洗脫劑用量為考察因素，龍膽苦苷的轉移率(y1)和干膏中龍膽苦苷的百分含量(y2)為評價指標，采用三因素五水平分析方法設計實驗，因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。數據處理采用“歸一化法”，運用Hassan[4]方法分別對各指標進行數學轉換求“歸一值”(dmax)，計算公式為dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，然后計算“總評歸一值(OD)”，計算公式為OD=(d1·d2···dn)1/n(n為指標數)。

表1 因素水平

表2 星點設計試驗與結果

2.3.3 模型建立與回歸分析 以OD值為因變量，使用Design-expert8.0.5b軟件對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，得多元線性回歸方程Y=-1.398 27+2.145a+0.018 6b+0.203 9c(r=0.604)，二項式擬合方程為Y=-12.065 7+10.309 8a+0.464 9b+1.632 0c-0.009 9ab+0.821 3ac-0.008 6bc-34.211 1a2-0.006 7b2-0.131 5c2(r=0.989)，線性回歸方程相關系數小，二項式擬合方程相關系數大，說明二項式擬合方程擬合效果好，可信度高，可用于對龍膽苦苷的純化工藝進行分析和預測。

2.3.4 工藝優化和預測 根據回歸方程，作相應曲面圖和等高線圖(圖1～圖3)，求導結果顯示，當上柱液質量濃度0.2g/mL，乙醇濃度為30.27%，乙醇用量為5.71BV時，OD值最大，龍膽苦苷的百分含量達到73.3%。考慮到實際生產情況，確定優化工藝為：上柱液質量濃度0.2g/mL，乙醇濃度為30%，乙醇用量為5BV。

2.3.5 驗證試驗 按優化后的最佳純化工藝進行3次平行試驗，結果表明，3次驗證試驗純化產物中龍膽苦苷的百分含量的實測值為73.2%、72.9%、72.4%，與預測值偏差分別為1.20%、0.87%、1.03%，說明模型預測性良好，二項式模型具有較高的可靠性。

3 討論

龍膽苦苷具有顯著的抗肝損傷、抗病毒、抗炎作用，具有重要的開發價值。本實驗采用星點設計-響應面法優化龍膽苦苷的大孔樹脂純化工藝，使干膏粉末中龍膽苦苷的百分含量最高達到73.2%，達到了提高有效成分相對含量的目的，可為減少以龍膽為主要成分的制劑的服用量提供參考，可為實驗室小量制備龍膽苦苷或工業大生產提供參考。

圖1 上樣液的濃度(a)和洗脫劑的濃度(b)的相互作用對龍膽苦苷純化工藝影響的效應面和等高線

圖2 上樣液的濃度(a)和洗脫劑用量(c)的相互作用對龍膽苦苷純化工藝影響的效應面和等高線

圖3 洗脫劑的濃度(b)和洗脫劑用量(c)的相互作用對龍膽苦苷純化工藝影響的效應面和等高線

[1] 黃泰康.現代本草綱目[M]. 北京：中囯醫藥科技出版社,2001.

[2] 楊書彬，王承. 龍膽化學成分和藥理作用研究進展[J].中醫藥學報，2006，33(6):54-56.

[3] 劉占文，陳長勛，金若敏，等. 龍膽苦苷的保肝作用研究[J].中草藥，2002，33(1):47-50.

[4] 吳偉，陸彬. 實驗設計中多指標的優化: 星點設計和總評“歸一值”的應用[J].中國藥學雜志,2000,35(8):530-533.

(責任編輯：宋勇剛)

Purification Process for Gentiopicroside by Response Surface Method

Xiang Zhiyun，Li Xiaofang*，Luo Kaipei，Luo Jia，Yang Lu，Lin Hao,Yan Minjia

(Chengdu University of TCM；Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines；System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base，Chengdu 611137，China)

Objective:The response surface method preferred gentiopicroside macroporous resin purification process.Methods:Pre-test and single factor test，according to the design-response surface methodology design principles，using three factors and five levels of response surface analysis methods to transfer rate and the percentage of gentiopicroside gentiopicroside for inspection indicators of concentration on the column，eluent concentration，eluent usage optimization，and ultimately determine gentiopicroside macroporous resin purification process.Results:HPD-100 macroporous resin，optimum purification process: the concentration of the liquid column 0.2g/mL，the ethanol concentration of 30%，the amount of ethanol 5BV，gentiopicroside percentages reach 73.4%.Conclusion:design-response surface methodology to optimize high gentian gentiopicroside purification process efficiency，easy way to predict，and can be used to prepare a small laboratory and provide reference for the expanded reproduction.

Gentian;Gentiopicroside;Design-response Surface Methodology;Macroporous Resin;Purification Process

2015-04-14

四川省教育廳重點項目(15ZA0094)

向志蕓(1990-)，女，成都中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥新劑型及中藥新技術。E-mail：498939565@qq.com

李小芳(1964-)，女，成都中醫藥大學教授，博士生導師，研究方向為中藥新劑型及中藥新技術。E-mail：lixiaofang918@163.com

R284

A

1673-2197(2015)17-0016-04

10.11954/ytctyy.201517009