固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定禽蛋中4種蘇丹紅染料殘留量

劉正才，楊 方，尹太坤，錢 疆

(1.福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室,福建 福州 350001；2.福州大學 石油化工學院,福建 福州 350108)

研究簡報

固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定禽蛋中4種蘇丹紅染料殘留量

劉正才1*，楊 方1，尹太坤2，錢 疆1

(1.福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室,福建 福州 350001；2.福州大學 石油化工學院,福建 福州 350108)

建立了禽蛋及其制品中4種蘇丹紅染料(蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ)殘留量的固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)測定方法。樣品經正己烷超聲提取，上清液經蘇丹紅專用SPE柱凈化，采用Waters CORTECSTMUPLC? C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 柱以5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸和乙腈為流動相梯度洗脫分離，電噴霧電離(ESI)正離子多反應監測模式(MRM)進行測定，內標法定量。結果表明，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在0.5～20 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999；在低、中、高3個加標水平的平均回收率為80.0%～104.2%，相對標準偏差為4.2%～10.9%。方法的檢出限(LOD)為0.26～0.35 μg/kg，定量下限(LOQ)為0.9～1.2 μg/kg。該方法操作簡便、準確、快速、靈敏，可用于禽蛋和蛋制品中蘇丹紅染料的檢測分析。

超高效液相色譜-串聯質譜法；固相萃取；蘇丹紅染料；禽蛋

蘇丹紅染料是非生物合成的親脂性偶氮化合物，常用于石油、機油、汽車蠟等工業產品的著色，由于其顏色鮮艷、不易褪色、價格低廉等特點，一些不法商販將其用于食品加工行業以謀利，但由于其致突變性和致癌性等危害性[1]，我國和歐盟等國家已禁止將蘇丹紅作為食用色素進行添加。目前，針對蘇丹紅的檢測方法國內外進行了大量的研究，檢測方法有薄層色譜-紫外分光光度法[2]、酶聯免疫分析法(ELISA)[3]、氣相色譜法(GC)[4]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[5-6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)[9-12]等，這些方法已經被廣泛應用于辣椒制品、蛋禽類制品、調味品等食品中蘇丹紅殘留量的檢測。我國和歐盟均以高效液相色譜法測定食品中蘇丹紅殘留量為標準，但由于食品種類繁多、基體復雜等因素的影響，該法表現出很多缺點，無法規避假陽性結果的出現，且前處理過程耗時耗力。本研究采用固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法技術，建立了同時測定禽蛋及其制品中4種蘇丹紅染料(蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ)殘留量的分析方法。該方法靈敏度高，定性定量準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC超高效液相色譜儀、WAT 200609真空提取裝置(美國Waters公司)；TripleQuad5500三重四極桿質譜儀(美國AB Sciex公司)；CR22G高速冷凍離心機(Himac日立公司);SBEQ-CA4954蘇丹紅專用SPE柱(上海安譜科學儀器有限公司)，使用前依次用3 mL二氯甲烷和3 mL 正己烷進行活化。

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標準品、同位素內標蘇丹紅Ⅰ-D5和蘇丹紅Ⅳ-D6(含量均>90.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸(色譜純，德國Merck公司)；正己烷、二氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 標準儲備液的配制

準確稱取蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標準品，用丙酮配制成0.1 mg/mL的儲備液，臨時用乙腈稀釋成不同濃度的混合標準溶液，4 ℃下避光保存。

1.3 動物實驗與樣品制備

選取20只約1.0 kg的母雞，分為空白對照組和試驗組，在散養的條件下適應性飼養1周，自由飲水與采食。之后以口灌的方式喂含有蘇丹紅染料的飯團，連續給藥5 d，從第6 d后開始取樣(雞蛋)；皮蛋、咸蛋購于當地市場。雞蛋、皮蛋、咸蛋樣品，去殼，均質后置于清潔樣品容器中，密封，將制備好的試樣于-18 ℃以下保存。

1.4 儀器條件

1.4.1 質譜條件 電離模式：正離子模式(ESI+)；檢測方式：多反應監測(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 000 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃；氣簾氣壓力(CUR)：0.241 MPa；輔助氣壓力0.379 MPa，定性、定量離子對和碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

表1 4種蘇丹紅染料的主要MS/MS參數

* quantitative ion

1.4.2 液相色譜條件 Waters CORTECSTMUPLC?C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸，B為乙腈，梯度洗脫程序為0～3 min,75% B;3～4 min，75%～100% B；4～6 min,100% B；6～7 min,100%～75%B;7～12 min,75% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。

1.5 樣品前處理方法

準確稱取5.0 g(±0.01 g)試樣于離心管中，加入100 μL 100 μg/L蘇丹紅內標標準工作液、2 g酸性氧化鋁和2 g無水硫酸鈉，再加入15 mL 正己烷，渦旋混勻1 min，100 W功率下超聲提取15 min，在15 000 r/min的速率下高速離心10 min，移出上清液，下層固體再用10 mL 正己烷提取1次，合并提取液并定容至25 mL容量瓶中。移取5 mL 上清液上樣至活化過的蘇丹紅專用柱中，以6 mL正己烷進行淋洗，棄去淋洗液，最后用5 mL二氯甲烷洗脫，收集流出液于玻璃管中，于45 ℃下氮吹至近干。用1 mL 1%氨水乙腈將殘渣重新溶解，渦旋10 s后過0.22 μm有機濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

蘇丹紅分子中含有氮原子，容易帶正電荷，因此使用ESI(+)電離模式。配制質量濃度為200 ng/mL的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ號混合標準溶液，通過蠕動泵直接進樣，在全掃描方式下找出準分子離子質譜峰[M+H]，然后改為子離子掃描模式作為檢測模式，以準分子為母離子進行子離子掃描。選擇子離子作為MRM檢測離子，進一步優化錐孔電壓、碰撞電壓等參數，得到最佳質譜條件(見表1)。

圖1 不同提取溶劑對蘇丹紅提取效率的影響(n=6)

2.2 提取溶劑的選擇

蘇丹紅類染料屬于脂溶性染料，有較強的疏水性，目前對蘇丹紅提取的溶劑主要有正己烷、乙腈、二氯甲烷等[13]。為取得較佳的萃取效果，對比了乙腈、正己烷、乙酸乙酯、乙腈-丙酮、乙腈-乙酸乙酯、正己烷-丙酮對雞蛋中蘇丹紅的提取效果，結果如圖1所示。由圖1可以看出，用正己烷提取蘇丹紅的回收率明顯高于其它試劑的回收率。基于正己烷自身的折射率較低，與溶質的作用也較弱，以及后續過程中宜于直接過柱凈化等諸多因素，最后確定以正己烷作為提取溶劑。進一步比較了振蕩萃取和超聲萃取兩種不同的萃取方式，結果表明，超聲萃取的效果較好，超聲萃取15 min時對蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的加標回收率均能達到90%～105%。

2.3 凈化方式的選擇

鑒于雞蛋基質中具有較多的脂肪和蛋白成分，而正己烷不僅能提取蘇丹紅染料，也能提取出大量的脂肪，而且不能較好地沉淀蛋白，因此，必須對提取液進行凈化。實驗在提取時加入適當的酸性氧化鋁和無水硫酸鈉，以去除沉淀蛋白和部分油脂。另外比較了3種固相萃取柱(C18柱、中性氧化鋁柱和SDR蘇丹紅專用柱)的凈化效果，發現蘇丹紅染料在中性氧化鋁柱上保留差異較大，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ保留較弱，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ保留較強，洗脫溶劑較多，凈化效果較差；C18柱由于采用正己烷洗脫容易堵塞，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ的回收率較差；SDR蘇丹紅專用柱以正己烷上樣，二氯甲烷洗脫，無需進行繁瑣的活度調節和活性測試，操作過程簡單，溶劑耗費少，4種蘇丹紅染料均具有較好的過柱回收率(84.5%～99.2%)。采用SDR蘇丹紅專用柱，考察了不同洗脫溶劑(丙酮、丙酮-正己烷、二氯甲烷)對蘇丹紅染料的洗脫效果，結果發現，二氯甲烷對4種蘇丹紅染料的洗脫效果最好，因此本實驗確定以二氯甲烷為洗脫溶劑，其洗脫曲線見圖2，最佳的洗脫體積為5 mL。

圖2 洗脫體積對蘇丹紅提取效率的影響

2.4 基質效應的評價與消除

本文通過配制標準工作曲線和基質曲線，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標作圖，以基質曲線和標準曲線的斜率求商來考察化合物的基質效應[14]。以空白溶劑、雞蛋提取液、SPE凈化液分別比較了低、中、高3個不同加標水平(1.0，2.0，10.0 μg/L)下的基質效應。測定結果表明，4種蘇丹紅染料在雞蛋提取液中均存在嚴重的基質抑制效應(Sudan Red Ⅰ：-38.2%；Sudan Red Ⅱ：-36.7%；Sudan Red Ⅲ：-68.4%；Sudan Red Ⅳ：-42.0%)，而在SPE提取液中則明顯降低(Sudan Red Ⅰ：-16.5%；Sudan Red Ⅱ：-15.8%；Sudan Red Ⅲ：-25.2%；Sudan Red Ⅳ：-22.8%)，這表明SPE可有效降低樣品中蘇丹紅系列目標物測定的基質效應。為減少基質效應對蘇丹紅染料定量結果的影響，本方法采用同位素內標法定量。由于市面上很難獲得每種化合物所對應的同位素內標，根據各化合物的色譜保留時間及其結構的相似性，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ采用SudanⅠ-D5，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ采用Sudan Ⅳ-D6分別作為內標進行定量。

2.5 蘇丹紅光學異構現象的解決

圖3 不同濃度氨水-乙腈溶液定容時第一色譜峰 的面積百分比(A1/A)

研究中發現在4種蘇丹紅染料的MRM色譜圖中，蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ在不同的保留時間分別出現兩個色譜峰。M?lder等[15]的研究表明，由于蘇丹紅染料分子結構中含有氮氮雙鍵，在光照條件下會發生順反互變異構，從而產生兩個色譜峰。在測定4種蘇丹紅染料的殘留時，由于順反異構現象從而會導致蘇丹紅染料定量不準確[16]。文獻[17]采用黑暗放置12 h較好的避免了這種現象，但操作時間過長。為解決此問題，本實驗研究了溶劑酸堿性對蘇丹紅Ⅲ，Ⅳ順反異構的影響，分別采用3種不同濃度的溶劑(甲酸-乙腈、乙腈-水、氨水-乙腈)定容，研究發現當采用濃度不小于1%的氨水-乙腈定容時，第一色譜峰(其面積用A1表示)會瞬間消失(見圖3)，兩色譜峰的面積總和(A)基本保持不變，說明第一色譜峰轉化為第二色譜峰，該方法快速、高效地避免了偶氮染料定量分析過程中產生的順反異構現象。蘇丹紅是一類萘酚偶氮染料，具有共軛平面性質，由于分子中酚羥基的存在使其易電離出H+，因此蘇丹紅所處溶液的酸堿性直接影響其分子的存在型體，使其在堿性溶液中主要以離子型體存在，氨水的加入會催化異構化，加快順反異構的轉變，致使第一色譜峰瞬間消失。

2.6 線性范圍與檢出限

采用SPE小柱凈化后的空白樣品溶液配制質量濃度分別0，0.5，1.0，2.0，5.0，10，20 μg/L的蘇丹紅系列混合標準溶液，按“1.4”方法進行測定。以蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的峰面積(y)對相應濃度(x,μg/L)作線性回歸分析。結果表明，在0.5～20 μg/L濃度范圍內，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ均呈良好的線性關系，相關系數(r)均大于0.999。采用空白樣品添加低濃度的4種標準品，按實驗方法進行前處理后，上機測定，以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)計算定量下限(LOQ)，得到雞蛋、皮蛋、咸蛋組織中蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的檢出限為0.26～0.35 μg/kg，定量下限為0.9～1.2 μg/kg(見表2)。

表2 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的線性方程、相關系數(r)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)

2.7 回收率與精密度

選取空白的雞蛋、皮蛋、咸蛋作為加標回收實驗的基質，分別進行1.0，5.0，10.0 μg/kg 3個不同水平的加標回收實驗，每個水平做6組平行實驗，結果如表3所示。在不同加標濃度下，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的回收率為80.0%～104.2%，方法的相對標準偏差(RSD)為4.2%～10.9%；采用日內進樣10次的方法考察重復性的精密度，并以每個加標濃度水平日間平行測定6次考察重現性的精密度，實驗結果顯示，相對標準偏差小于11%，表明方法具有較好的回收率及穩定性。空白雞蛋加標樣品的色譜圖見圖4，可看出各化合物的峰形良好，且目標物出峰處無雜峰干擾。

表3 蛋品中蘇丹紅的加標回收率與相對標準偏差(n=6)

圖4 雞蛋中添加1.0 μg/kg 4種蘇丹紅藥物的MRM離子流色譜圖

2.8 實際樣品的檢測

按“1.3 ”方法進行蘇丹紅動物殘留代謝的模擬實驗，給雞喂飼含有蘇丹紅染料的飯團，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ按4 mg/kg體重/次給藥，蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ按2 mg/kg體重/次給藥，連續喂藥5 d。取停藥后5 d收集到的雞蛋樣品，去殼后混勻全蛋液，按“1.5”方法處理后檢測其殘留量，得到陽性雞蛋樣品中蘇丹Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ的平均含量分別為2.9，18.6，135,408 μg/kg。

3 結 論

針對蛋白和油脂含量較高的禽蛋及其制品，本方法采用酸性氧化鋁和蘇丹紅專用柱進行有效凈化，建立了一套采用固相萃取凈化，結合超快速液相色譜-串聯質譜測定其中蘇丹紅染料的分析方法。該方法操作簡便，準確度和靈敏度高，適用于禽蛋及其制品中痕量蘇丹紅染料的殘留檢測。

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Simultaneous Determination of Four Sudan Red Dyes Residues in Poultry Eggs by Solid-phase Extraction Combined with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Zheng-cai1*,YANG Fang1,YIN Tai-kun2,QIAN Jiang1

(1.Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research,Fuzhou 350001,China;2.School of Chemical Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

A solid-phase extraction combined with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was established for the simultaneous determination of Sudan Red dyes(Sudan RedⅠ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ) in poultry eggs and its products.The samples were ultrasonically extracted withn-hexane,and then the supernatant was purified with tonyred dedicated SPE column.The chromatographic separation was performed on a Waters CORTECSTMUPLC? C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) by gradient elution with 5 mmol/L ammonium acetate solution containing 0.2% formic acid and acetonitrile as mobile phase.The electrospray ionization(ESI) source in the positive mode and multiple-reaction monitoring(MRM) mode were used for the quantitative analysis by the internal standard.The results showed that the calibration curves for four Sudan Red dyes were in good linearities in the range of 0.5-20 μg/L with correlation coefficients more than 0.999.The average recoveries ranged from 80.0% to 104.2% with relative standard deviations(RSDs) of 4.2%-10.9% in low,medium and high standard addition levels.The limits of detection(LODs) and the limits of quantitation(LOQs) of this method were in the ranges of 0.26-0.35 μg/kg and 0.9-1.2 μg/kg for four analytes,respectively.The method was simple,accurate,rapid and sensitive,and could be used for the analysis of Sudan Red dyes in poultry eggs and egg products.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);solid phase extraction;Sudan Red dyes;poultry egg

2014-09-16；

2014-10-20

福建檢驗檢疫局科技計劃項目(FK2010-23);質檢公益項目(201310143-02);福建省科技重點項目(2012Y6001)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.008

O657.63；F767.4

A

1004-4957(2015)02-0171-06

*通訊作者：劉正才,碩士,高級工程師,研究方向：農獸藥殘留分析，Tel:0591-87065542,E-mail:zhengcailiu@163.com