膀胱尿路上皮癌中TGF-β1 和DPC4 的表達及臨床意義

楊濤 李燕 李巖 劉俊江 孫福振 王剛

膀胱腫瘤是在泌尿系統中最為常見的惡性腫瘤，多發生在老年人，病死率很高，其中膀胱尿路上皮癌是最為常見的病理類型，容易浸潤、進展、復發，目前不可治愈，并且病因不明確。除了環境因素、化學因素外，膀胱腫瘤的發生和進展同時也涉及到了復雜的分子遺傳學因素，包括染色體核型的異常、基因突變、表觀遺傳學的改變等。為能更早期的發現、診斷、治療，并防止其進展，有很多問題有待解決。近來我們發現膀胱尿路上皮癌的發生、發展與某些基因的表達異常及一些信號通路異常有關系，如Wnt/β-catenin 通路、Notch通路等的異常激活。目前認為若腫瘤細胞喪失了對于TGF-β 的生長抑制的敏感性，極有可能會導致腫瘤的浸潤以及轉移，抵制抗腫瘤的免疫反應。它在腫瘤細胞中的浸潤和轉移方面可能發揮重要的作用。并且發現TGF-β 與多種信號通路異常有關。DPC4 基因主要是能夠作為保守序列SMADs 蛋白家族中，并且能夠直接參與轉化TGF-β 在實際的細胞內部中進行信號傳導的相關功能，并且在TGF-β 的超家族的信號傳導過程中是出于中樞地位的，并且有研究表明DPC4 基因的失活以及缺失始于一些腫瘤的發生和發展有著較大的關系。如何更有效防止惡性腫瘤細胞浸潤轉移，防止腫瘤的發生、發展，并延長患者的生存期將成為焦點問題。我院使用免疫組織化學法討論TGF-β1 以及DPC4 與膀胱移行細胞癌之間的關系，說明了膀胱尿路上皮癌發生發展相關過程分子生物學相關機制，取得了較好的效果，有助于膀胱尿路上皮癌的診斷，為膀胱癌的發生、發展提供理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2013 年5 月至2014 年5月收集的膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊共50 例，其中男38 例，女12 例;通過相關病理學證實，所有存檔蠟塊均為膀胱尿路上皮癌，年齡35 ～68 歲，平均年齡(50.13 ±1.26)歲。同時需要手機5 例膀胱尿路上皮癌的癌旁組織，所有的癌旁組織距離腫瘤邊緣3 ～5 cm，并且所有標本均未經過HE 染色，通過對WHO尿路腫瘤組織學分類的相關使用，我們發現所有存檔蠟塊中的浸潤性尿路上皮癌共31 例、非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌19 例，其中高級別15 例，低級別4 例。其中未經過化療治療的初發腫瘤29 例，經過化療后的復發腫瘤為21 例。

1.2 治療方法 在本次研究中，需要使用免疫組織化學S-P 法對膀胱尿路上皮癌的50 例存檔蠟塊以及5例癌旁組織中的TGF-β1 和DPC4 表達水平。首先需要對所有的標本進行一般方式下的取材，同時取材完成后需要進行固定脫水以及包埋和切片的相關處理，在處理完成后需要進行HE 染色和封片的處理。在本次研究中我們選擇兔抗人TGF-β1 多克隆抗體以及即用型的兔抗人DPC4 多克隆抗體。同時也需要使用超敏即用型的SP 通用型的免疫組織化學試劑以及DAB顯色試劑盒以及聚賴氨酸，也需要準備好在實際的免疫組織化學法中需要檢測出的TGF-β1 和DPC4 相關抗原。第一步是需要將5 μm 組織切片進行常規處理即脫蠟脫水的相關處理，并且需要在0.01 mmol/L PBS 中進行3 ×3 min 進行抗原修復，并在室溫情況下進行冷卻后，需要在0.01 mmol/L PBS 中進行漂洗5 ×3 min，并需要進行3%的過氧化氫進行滴入，在滴入完成后，在37℃的環境下孵育10 min，甩去多余的血清，再分別滴入一抗，在4℃的環境下進行孵育過夜，在0.01 mmol/L PBS 中進行3 ×5 min 的漂洗，并且滴入二抗，在37℃的環境下進行10 min 的孵育，在0.01 mmol/L PBS 中進行3 ×3 min的漂洗，并需要滴入新鮮的DAB 顯色液進行顯色，使用光鏡下進行反應時間的控制，并需要使用蘇木素進行復染，隨后使用流水沖洗，并使用0.1%的氨水進行返藍處理，對標本進行封片以及鏡檢。在鏡檢完成后需要使用HPIAS-1000 對TGF-β1 和DPC4 的表達進行觀察和定量分析，計算陽性反應面積、平均光密度以細胞總面積，最后需要對陽性面積率進行計算。

1.3 統計學分析 應用PSS 17.0 統計軟件，計量資料以± s 表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌與癌旁組織中的表達情況 通過本次研究我們使用了免疫組織化學法的方式進行了研究。在本次研究完成后我們發現，TGF-β1在膀胱尿路上皮癌組織中呈現出高表達的情況，在正常的癌旁組織中呈現出一種低表達的情況，在患者的膀胱尿路上皮癌中的平均光密度為0.2542 ±0.0068，陽性面積率為0.2678±0.0061，但在患者的癌旁組織中的平均光密度為差異為0.0358±0.0012 陽性面積率為0.0488±0.0018，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.2 DPC4 在膀胱尿路上皮癌與癌旁組織中的表達情況 同時DPC4 在膀胱尿路上皮癌組織中呈現低表達情況，在癌旁組織中呈現高表達情況，在患者的膀胱尿路上皮癌中的平均光密度為0.0586 ±0.0052，陽性面積率為0.0625 ±0.0053。但在患者的癌旁組織中的平均光密度為0.3129 ± 0.0078，陽性面積率為0.3192 ±0.0073，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1、2。

表1 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中TGF-β1 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

表1 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中TGF-β1 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

組別 平均光密度 陽性面積率膀胱尿路上皮癌(n =50)0.2542 ±0.0068 0.2678 ±0.0061癌旁組織(n =5) 0.0358 ±0.0012 0.0488 ±0.0018 t 值71.1248 79.324 P 值0.0000 0.0000

表2 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中DPC4 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

表2 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中DPC4 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

組別 平均光密度 陽性面積率膀胱尿路上皮癌(n =50)0.0586 ±0.0052 0.0625 ±0.0053癌旁組織(n =5) 0.3129 ±0.0078 0.3192 ±0.0073 t 值99.668 99.9339 P 值0.0000 0.0000

3 討論

膀胱腫瘤是發生于膀胱黏膜上的一種惡性腫瘤，它是是泌尿系統中非常常見的一種惡性腫瘤，占到我國泌尿系統惡性腫瘤發病率的首位。研究表明，膀胱癌可以發生在任何年齡段，也可以發生在兒童。并且膀胱腫瘤的發病率是隨著年齡的增長而增加，據統計膀胱腫瘤的高發年齡在50 ～70 歲，同時發現男性的膀胱腫瘤的發病率是女性膀胱腫瘤的4 倍。膀胱腫瘤中最常見的事來自于尿路上皮，它的發生發展是通過各種基因的參與，同時在多種細胞因子的調控下的復雜過程，而且腫瘤細胞的浸潤及轉移往往是膀胱腫瘤中最為致命的因素。因此可以看出研究膀胱腫瘤的發生及發展，浸潤的分子機制有很重要的實際意義和臨床價值。膀胱尿路上皮癌是泌尿系統中最為常見的一大類疾病，由于膀胱尿路上皮癌的特點，在實際的發病過程中，死亡率較高，同時目前膀胱尿路上皮癌的發病率以及死亡率也呈現出一種上升的趨勢，此病的侵襲性較強，可較早發生轉移，這可能與吸煙、環境污染以及職業等因素有關，但確切的病因目前仍然在進一步的探索。所以若能夠發現膀胱尿路上皮癌的發病機制及分子作用機理，可能為疾病的預防及防止其進展而奠定理論基礎。

在實際的對膀胱尿路上皮癌進行研究的過程中，Liu 等［4］研究顯示轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)以及這種因子的相關家族成員對患者組織內環境的中樞相關作用能夠起到較大的作用，在實際的使用過程中能夠將患者的細胞死亡、凋亡以及生長進行相應的調節，同時也可以將患者的細胞外基質的合成以及分化進行相應的調節，是一種在組織內部環境和發育過程中能夠有著中樞作用的多功能因子，在使用的相關過程中有著調節細胞凋亡的相關功能，同時也有著細胞外合成以及細胞分化相關的不同生物學功能，同時TGF-β 的最重要的生物學功能就是對上皮細胞產生抑制，若腫瘤細胞喪失了對于TGF-β的生長抑制的敏感性，極有可能會導致腫瘤的浸潤以及轉移，抵制抗腫瘤的免疫反應。近年來TGF-β 的功能作用逐漸被認識，它不僅可以促進惡性腫瘤的血管增生、浸潤、轉移、免疫抑制等作用。TGF-β 還可以激活周細胞及血管平滑肌細胞增生和分化，對于DPC4基因而言，最為主要的功能是作為序列保守SMADs 蛋白家族中的一員，能夠在轉化因子TGF-β 的相關細胞內部信號的實際傳導過程中起著較為重要的作用，同時在實際的TGF-β 超導體家族中的信號傳導是一種中樞的相關地位，并且在以往有研究表明DPC4 基因的缺失以及失活等情況也與腫瘤的發生和發展有著較大的關系。到目前為止，在上皮細胞癌的細胞所發揮其功能作用的研究過程中，己經逐步闡明TGF-β 通路、SDF-1/CXCR4 通路、FGF 通路、Notch 通路、Wnt/β-catenin 通路等眾多條分子信號通路與上皮癌細胞發生、發展之間的過程關系緊密，有部分研究表明wnt5a 與膀胱尿路上皮癌的發生、發展、轉移密切相關。其中在這些通路中，以TGF-β 分子信號通路最為研究對象，研究的比較多。TGF-β 是一類二聚體多肽，主要表達于在內皮細胞、血細胞、結締組織細胞和上皮細胞中。TGF-β 同時也是一種生長因子，具被調節細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學功能。近年的研究表明，TGF-β 還具有刺激惡性腫瘤血管的增生、侵襲、轉移，并對宿主細胞有免疫抑制作用，以及促使腫瘤細胞增殖等多種作用。TGF-β 在惡性腫瘤血管生成中的的調控作用，主要影響血管內皮細胞增生，同時TGF-β作為一種很強的的趨化因子，可以吸引巨噬細胞和成纖維細胞，并且釋放bFGF、PDGF、TNFα 等多種血管活性因子。除此之外，TGF-β 還可以促使新生血管的生成，并進一步導致腫瘤發生、發展及轉移。

DPC4 是一種新發現的抑癌基因，研究表明與胃腸道腫瘤的發病關系密切，但最近發現DPC4 與多種腫瘤的發生、發展及其作用密切關聯。DPC4 基因是定位在人的染色體的18q21.1，由552 個氨基酸組成，其中有11 個外顯子，10 個內含子。它的cDNA 全長是由1656 堿基組成。DPC4 蛋白是TGF-β 信號中細胞內傳導的重要元素之一。TGF-β 可以誘導細胞的生長抑制作用，使細胞明顯增殖從而形成腫瘤。另外研究發現，DPC4 基因的突變可以使Smad4 蛋白結合的活性喪失，從而使其通路中的基因轉錄調控失活而發生異常，造成腫瘤的形成。

在本次研究中，我們利用了免疫組織SP 法對患者的膀胱尿路上皮癌中的TGF-β1 和DPC4 的表達進行相關的檢測，通過這種方式就能夠了解到TGF-β1 和DPC4 在實際的膀胱尿路上皮癌發生以及發展過程中的相關關系。在本次研究中我們可以發現，TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌組織中是一種高表達的情況，但在患者正常的癌旁組織中為低表達，并且二者有顯著差異，有統計學意義，對于DPC4 而言，在癌旁組織中呈現出高表達，但在膀胱尿路上皮癌組織中呈現出低表達。二者有顯著差異，并有統計學意義。通過進一步的分析我們發現，這極有可能會由于DPC4 發生基因的突變或缺失會阻斷TGF-β1，從而抑制腫瘤生長的相關通路。但這種作用會發生相關的負反饋作用，因此會導致細胞分泌的TGF-β1 發生提升，而通過TGF-β1 和DPC4 共同調節的形式可能會影響到惡性腫瘤的發生發展，為今后的早期治療干預及預防提供理論基礎。

Schwarte-Waldhoff 等［7］研 究 顯 示，TGF-β1 和DPC4 是TGF-β 在實際的傳導過程中起著關鍵作用的相關因子，TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌中表達程強陽性，在癌旁組織中表達較弱，它的平均光密度及陽性表達率與癌旁組織比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。DPC4 在膀胱尿路上皮癌中表達較弱，在癌旁組織中的表達程強陽性，它的平均光密度及陽性表達率與癌旁組織比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。通過DPC4 的低表達以及TGF-β1 的高表達，我們發現能夠作為膀胱尿路上皮癌早期治療過程中的重要因素，同時我們也能夠發現，DPC4 在TGF-β1 的信號傳導過程中有著極為關鍵的作用，DPC4 的缺失或是突變極有可能會對TGF-β1 的生長抑制發生耐受，從而導致膀胱尿路上皮癌的發展。同時通過Lin 等［10］研究顯示，DPC4 在膀胱尿路上皮癌中的低表達，也能夠說明TGF-β1 抑制腫瘤生長的相關傳導通路被阻斷，而通過阻斷的相關作用，在實際的轉錄過程中得到較好的體現。由此可見，DPC4 的低表達以及TGF-β1 的高表達都極有可能會導致腫瘤細胞的免疫逃逸發生，但其機制需要進一步探討。

1 陜光，唐甜.抑癌基因DPC4 和TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌中的表達和意義.中國組織化學與細胞化學雜志，2011，20:491-495.

2 牛堅.TGF-β1、MMP-2、DPC4、CyclinE、P27 在原發性膽囊癌中的表達及臨床意義.南通醫學院，2003.

3 張東偉.抑癌基因DPC4 和轉化生長因子β1(TGFβ1)在大腸癌組織中的表達及臨床意義.哈爾濱醫科大學，2005.

4 Fang L，Celio P，Massagué J.Dual role of the Smad4/DPC4 tumor suppressor in TGFβ-inducible transcriptional complexes.2004.

5 Song CZ，Siok TE，Gelehrter TD，et al.Smad4/DPC4 and Smad3 mediate transforming growth factor-beta (TGF-beta)signaling through direct binding to a novel TGF-beta-responsive element in the human plasminogen activator inhibitor-1 promoter.The Journal of Biological Chemistry，1998，273:29287-29290.

6 Long JY，Wang GN，Matsuura I，et al.Activation of Smad transcriptional activity by protein inhibitor of activated STAT3 (PIAS3).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101:99-104.

7 Schwarte-Waldhoff I，Volpert M，Olga V.Smad4/DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis.2001.

8 Long JY，Matsuura I，He DM，et al.Repression of Smad transcriptional activity by PIASy，an inhibitor of activated STAT.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100:9791-9796.

9 Nagarajan RP，Chen Y.Structural basis for the functional difference between Smad2 and Smad3 in FAST-2 (forkhead activin signal transducer-2)-mediated transcription.The Biochemical Journal，2000，350:253-259.

10 Lin X，Liang M，Liang YY，et al.Activation of transforming growth factor-beta signaling by SUMO-1 modification of tumor suppressor Smad4/DPC4.The Journal of Biological Chemistry，2003，278:18714-18719.