VEGF-D 在結直腸癌中的表達及與微血管密度的關系

曹懷宇 成雪梅 魏磊彬

結直腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，隨著對結直腸癌的發生和轉移機制的深入研究，通過測定微血管密度(MVD)，發現腫瘤中新生血管數量越多癌組織發生轉移的可能性越大［1］;研究表明，VEGF-D與受體結合后，能起到促進細胞分裂，毛細血管擴張，內皮細胞增殖和提高血管通透性的作用［2］。同時，VEGF-D 還能增加淋巴管系統的通透性，促使腫瘤細胞進入淋巴管。有關結直腸癌中VEGF-D 表達的研究國內外報道均較少。本研究通過免疫組化檢測結直腸癌組織中VEGF-D 表達情況并探討其與MVD 的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008 至2012 年在中國人民解放軍第251 醫院就診的的原發性結直腸癌術后標本60 例，均有明確的病理組織學診斷結果，所有患者在術前均未經任何治療，所有病例資料完整。60 例結直腸癌患者中，男35 例，女25 例;年齡45 ～65 歲。臨床分型:隆起型10 例，潰瘍型36 例，浸潤型5 例，其他類型9 例;組織學類型依照2003 版美國腫瘤聯合會(AJCC)分類標準分類:高分化腺癌14 例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌23 例;根據國際抗癌聯盟(UICC)制定的TNM 分類標準(2003)分期:Ⅰ期的5 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期20 例，Ⅳ期18 例。病理證實伴有淋巴結轉移41 例，無淋巴結轉移19 例;有遠處轉移18 例，無遠處轉移42 例。

1.2 試劑 鼠抗人VEGF-D 單克隆抗體:美國R ＆D公司、LSAB 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 將所選取的病例標本常規行HE 染色確定病理類型。免疫組化染色程序按LSAB 免疫組化染色試劑盒說明書進行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，以福州邁新公司提供的陽性片作陽性對照。

1.4 結果判定 VEGF-D 的蛋白陽性產物主要表達于細胞質，以出現棕黃色顆粒記為陽性細胞，依陽性細胞占所觀察細胞的百分比和著色的強度來綜合計分。由兩位高年資病理醫師分別雙盲閱片，隨機選取5 個高倍鏡視野計數陽性細胞百分比的平均數，按腫瘤細胞陽性細胞數量記為0 ～3 分，即陽性細胞數目為＜10%為0 分，10% ～50%為1 分，51% ～75%為2 分，＞75%為3 分;按著色強度記為0 ～3 分，即無色為0分，灰黃色為1 分，金黃色為2 分，棕黃色為3 分;最后，將兩項指標的評分相加，根據總的分數分為2 級，0～2 分為陰性，≥3 分為陽性。微血管計數參照Weidner 方法［3］。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0 統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF-D 在不同結直腸組織中的表達 VEGF-D蛋白在結直腸癌、結直腸腺瘤、正常組織標本中的陽性率分別是75.0%、40.0%和20%，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見表1。

表1 VEGF-D 在結直腸黏膜、腺瘤和結直腸癌組織中的表達例

2.2 VEGF-D 的表達與結直腸癌臨床、病理特征間的關系 VEGF-D 的陽性表達均與患者的TNM 分期、淋巴結轉移情況以及遠處轉移情況相關(P ＜0.05)。見表2。

表2 VEGF-D 的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 例

3 討論

VEGF-D 基因位于染色體Xp22-23，含有8 個半胱氨酸殘基。人VEGF-D 的cDNA 序列含有419 個堿基對，其中的開放閱讀框架編碼一種含有354 個氨基酸的多肽，該多肽被命名為VEGF-D 蛋白。VEGF-D可與VEGFR-2 和VEGFR-3 結合，但不能與VEGFR-1結合。研究發現，VEGFR-3 通過與VEGF-D 結合并被激活，導致淋巴管生成、增生或擴張且數目增加［1］，而淋巴管密度的增加與淋巴結轉移密切相關，是促進腫瘤發生淋巴結轉移的重要原因［2，4］。由于VEGF-D 能增加淋巴管道系統的通透性，促使腫瘤細胞進入淋巴管，進入淋巴管中的腫瘤細胞則又通過胸導管擴散到血管系統中，從而間接促進了腫瘤的血道轉移。

有關結直腸癌中VEGF-D 表達的研究國內外報道均較少，目前的研究結果顯示結直腸癌患者癌組織中VEGF-D 的表達增高。Juttner 等［5］通過分析VEGF-D與VEGFR-3 的染色結果與患者生存率之間的關系發現，VEGF-D 陽性與降低腫瘤的特異性生存率和降低無病生存率均呈明顯相關。多元回歸分析也顯示，VEGF-D 可獨立的作為消化道腫瘤特異性生存率與無病生存率的預后因子。本研究表明，在結直腸癌組織中VEGF-D 的陽性表達率明顯高于結直腸腺瘤組織及正常結直腸黏膜組織。VEGF-D 的表達與患者的TNM分期、淋巴結轉移情況以及遠處轉移情況相關。TNM分期高、伴有淋巴結轉移以及有遠處轉移的患者VEGF-D 表達強，與劉寶全等［6］的研究結果一致。

人類VEGF-D 與VEGF-C 的序列有48%相同，牟江洪等［7］的研究認為，結直腸癌淋巴管內皮細胞增殖活躍，表明癌組織可能存在新生淋巴管，尤其是在結直腸癌浸潤的邊緣區域，且這些新生淋巴管與VEGF-C和VEGF-D 表達密切相關［8］，提示VEGF-C 和VEGFD 可能誘導結直腸癌尤其癌周淋巴管生成［3，9，10］。本實驗結果也表明，VEGF-C 及VEGF-D 在結直腸癌的表達呈正相關，VEGF-D 在VEGF-C 陽性組中的表達明顯高于其在VEGF-C 陰性組中的表達，也進一步印證了上述學者的研究結果。當然，VEGF-C 與VEGF-D在結直腸癌表達具有相關性的機制仍需要大量資料去進一步證明及探討。

1 Cross MJ，Dixelius J，Matsumoto T，et al.VEGF-receptor signal transduction.Trends Biochem Sci，2003，28:488-494.

2 初同偉，朱佩芳.血管內生長因子的基礎及臨床應用研究.中國臨床康復，2002，6:570-571.

3 Makinen T，Veikkola T，Mustjoki S，et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.EMBO J，2001，20:4762-4773.

4 Van der Auwera I，Van den Eynden GG，Colpaert CG，et al.Tumor lymphangiogenesis in inflammatory breast carcinoma:a histomorphometric study.Clin Cancer Res，2005，11:7637-7642.

5 Juttner S，Wissmann C，Jons T，et al.Vascular endothelial growth factor-D and its receptor VEGFR-3:two novel independent prognostic markers in gastric adenocarcinoma.J Clin Oncol，2006，24:228-240.

6 劉寶全，張雅芳，馬晶，等.血管內皮生長因子D 和血管內皮生長因子受體3 在人結腸癌中的表達及淋巴道轉移中的作用.解剖學報，2007，38:56-60.

7 牟江洪，肖華亮，向德兵，等.VEGF-C 和VEGF-D 誘導結直腸癌癌周淋巴管生成.腫瘤，2006，26:815-818.

8 石艷華，葉紅，關麗華，等.大腸正常粘膜、腺瘤及癌組織中VEGF 及其受體Flk-1 表達的意義.河北醫藥，2007，29:107-108.

9 White JD，Hewett PW，Kosuge D，et al.Vascular endothelial growth factor-D expression is an independent prognostic marker for survival in colorectal carcinoma.Cancer Res，2002，62:1669-1675.

10 趙阿紅，尹玉慧，李惠翔，等.乳腺癌組織中VEGF、VEGF-D、VEGFR-3 表達與血管及淋巴管生成的相關性探討.山東醫藥，2008，51:32-33.