Ang1一Akt途徑對大鼠體外血一脊髓屏障功能的調節

劉欣春 李杰 裴磊 王森 彭云飛

摘 要：檢測血管生成素1（angiopoietml，Angl）對體外培養脊髓微血管內皮細胞（spinal cord nucrovascular en-dothelial cell，SCMEC）屏障功能的調節機制。體外分離培養大鼠SCMEC及膠質細胞，通過雙室培養系統建立體外血一脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）模型；分別用Angl及Angl+wortmannin（Akt抑制劑）處理培養細胞，Western-blot檢測Akt及連接蛋白質的表達：放射自顯影檢測Akt激酶活性變化：測定跨內皮電阻（TEER）反映各組細胞屏障功能；細胞免疫熒光檢測連接蛋白在細胞接觸面的分布變化；免疫共沉淀實驗分析連接蛋白之間的相互作用改變。結果顯示，Angl處理組細胞Akt活性及TEER值均有明顯升高，Angl處理后ZO-1及VE-cadherin在細胞連接處的分布增強，occludin/ZO-l、VE-cadherin/p-catenin之間的相互作用均較對照組顯著增強，且以上Angl處理所引起的SCMEC功能改變均可被wortmannin所拮抗。表明Angl通過Akt活性調節SCMEC連接蛋白的分布及相互作用，從而影響體外BSCB的屏障功能。

關鍵詞：血一脊髓屏障；血管生成素l（ Angl）；Akt

中圖分類號：R33 8.2+1 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0218-06 脊椎動物的血一脊髓屏障（ blood-spinal cordbamer，BSCB）是血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的延伸，是中樞神經系統特有的屏障結構。BSCB由脊髓微血管內皮細胞（spinal cord mi-crovascular endothelial cell，SCMEC）間的緊密連接及星形膠質細胞周足構成，可有效地阻止血液中的大分子進入脊髓實質，為中樞神經系統提供穩定的微環境[I]?，F有研究表明，多種脊髓病變與BSCB屏障功能異常有關，如創傷性脊髓損傷[2，3]、放射性損傷[4] 、肌萎縮性脊髓側索硬化癥[5，6] 、感染[7J等。內皮細胞間的連接蛋白及細胞骨架是構成內皮細胞屏障的主要分子基礎，其表達量、分布及相互作用的改變是導致內皮細胞通透性增高的直接原因[8] 。

血管生成素（ angiopoietin，Angl）是一種有效的血管生成因子，參與血管生成的各個階段，許多其他血管生成因子可通過Angl誘導新血管的生成。在血腦屏障，Angl作用于Tie-2酪氨酸激酶受體，參與維持屏障完整性及血管穩定[9，10]；近期有研究報道，Angl可通過上調緊密連接蛋白ZO-2（zonula occludens-2）穩定腦微血管內皮細胞哦在非中樞神經系統微血管內皮細胞，Angl可通過PI3 K/Akt途徑發揮抗凋亡[12]及維持血管穩定性的作用[l3]。本研究以分離培養的大鼠SCMEC為研究對象，在體外建立BSCB模型，探討Angl-Akt途徑對血脊髓屏障的通透性影響并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

成熟Sprague-Dawley大鼠（275～300 g）由中國醫科大學實驗動物部提供。DMEM/F12培養基為Sigma公司（美國）產品；堿性成纖維細胞生長因子（ bFGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素l（Angl）購自Peprotech公司（美國）；Wort-mannln購自Gene Operation（中國）；蛋白G瓊脂糖購自Pierce公司（美國）；PKA抑制肽購自Merck Millipore公司（德國）；組蛋白H2B為EnzoLife Sciences公司（瑞士）產品；y-32PlATP購自北京福瑞生物科技有限公司（中國）；兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO—1、盧-catenin抗體、驢抗兔IgG（ FITC）、Prolong Gold Antifade封片劑購自Invit-rogen公司（美國）；山羊抗大鼠Aktl、p-actin、兔抗大鼠pAk[抗體、牛抗山羊IgG（ HRP）、?？雇肐gG（HRP）購自Santa Cruz公司（美國）；兔抗大鼠VE-cadherin購自Abcam公司（美國）；DC蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司（美國）；增強型化學發光試劑盒購自Pierce公司（美國）；其他常規試劑為Sigma公司（美國）產品。

1.2主要儀器設備

Millicell～ ERS-2細胞電阻儀；MiⅡipore Milli-cell插入式細胞培養皿；Beckman液閃計數儀；Bio-Rad電泳儀及電泳槽；Eppendorf臺式低溫離心機；蘇凈VS-1300U超凈臺；Thermo ScientificSeries8000 C02細胞培養箱；Olympus BX51熒光顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠脊髓微血管內皮細胞（SCMEC）的分離培養

按本實驗室常規方法分離培養大鼠SCMEC。成熟SD大鼠C02窒息處死，手術分離椎管后注射冷D-Hanks液以分離脊髓組織，去除腦脊膜及大血管。冷DMEM/F12培養液中剪碎組織至1 mm3大小，冰上勻漿后于37 °C水浴膠原酶Ⅱ消化30 min。消化產物200 g離心5 min，220/o BSA重懸組織沉淀，2 000 g離心10 min，棄上層髓磷脂成分，DMEM/F12清洗下層血管組織。無菌濾器（BD Falcon，295 lim及40 μm）依次過濾以進一步去除大血管及血細胞，收集微血管組分。0.1%膠原酶及脂肪酶于37 0C消化脊髓微血管30 min.間歇攪拌并鏡下觀察，待內皮細胞出芽呈串珠樣時1000xg離心5 min終止消化。SCMEC培養液（DMEM/F12、1 0%胎牛血清、10%馬血清、2 mmol/L谷氨酸鈉、l g/L肝素、1μg/L bFGF、10 μg/L VEGF、50 mg/L慶大霉素、3p，mol/L嘌呤霉素）重懸消化后的微血管組分，接種于預鋪IV型膠原及纖連蛋白（均為5 μg/cm2）的培養平板，接種密度為lx1 04/cm2。培養6d待細胞融合成單層后常規免疫熒光觀察因子Ⅷ表達情況，確定SCMEC分離培養純度> 95%。

0.125 010胰酶（含0.020/0 EDTA）消化SCMEC，按不同密度進行傳代：1）1：1接種于6孔培養板，用于蛋白樣品制備；2）1：5接種于6孔培養板（內預置蓋玻片），用于細胞免疫熒光；3）1：1接種于Millicell插入小室，置于24孑L板（預鋪膠質細胞）中，用于跨內皮電阻（TEER）測定。所有培養細胞于37℃50/0 C02培養箱中培養7d，每2—3 d更換培養液。

1.3.2血管生成素1（Angl）處理培養細胞

為檢測Angl對體外SCMEC屏障功能的影響，于培養第7d用Angl （0.1 mg/L）或Angl（ 100 mg/L） +Wortmannin（0.1 μmol/L）處理細胞12 h，于不同時間點（0、4、8、12 h）測量Angl處理后跨內皮電阻變化，并收集SCMEC進行激酶活性測定及免疫印跡等檢測。

1.3.3 Akt激酶活性測定

通過測定Akt底物蛋白H2B的磷酸化狀態反映Akt激酶活性，具體如下：收集SCMFC制備蛋白裂解液，蛋白G瓊脂糖4℃預孵育30 min后加入抗Akt抗體免疫沉淀2h，離心后依次用裂解液、純水及激酶反應液（50 mmol/L HEPES、10 mmol/l_ MrlCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇、1μmol/L PKA抑制劑，pH 7.2）清洗沉淀。在反應液中加入20 μCi/mL[γ-32P]ATP及0.2g/L組蛋白H2B，30 °C孵育10 min。取25 μL反應液滴于Whatman p81陽離子交換濾紙，5%磷酸溶液終止反應，充分清洗后放人含10 mL蒸餾水的液閃瓶內，Beckman液閃計數儀測定cpm值。

此外，本研究亦采用放射自顯影檢測Akt激酶活性，即在上述激酶反應液中加入50μCi/mL[γ-32P]ATP及組蛋白底物，30 0C孵育30 min后用SDS樣品緩沖液終止反應，SDS-PAGE分離蛋白成分后放射自顯影觀察H2B的磷酸化狀態。1.3.4跨內皮電阻（TEER）測定

使用Millicell⑩ERS-2細胞電阻儀測量雙室培養系統中SCMEC跨內皮電阻值，以反映其內皮屏障功能及通透性。在Angl處理后不同時間點（每個時間點設置3個平行孔），將正負電極分別置于培養內室及外室，記錄待測孔電阻值（Ru），按公式TEER=（Ru-Rc）xS計算各組TEER值（ Ω·cm2），其中Rc為未接種細胞空白孔電阻值，S為培養面積。

1.3.5免疫印跡及免疫共沉淀

收集各組SCMEC，Nonidet P-40裂解液（ 50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EG-TA，lO% glycerol.l% Nonidet P-40.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3V04，1μg/mL亮肽素，1 mg/L抑肽酶，pH 7.4）處理后提取總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度后制備蛋白樣品。每組按30 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳分離蛋白成分，轉印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，依次經一抗、二抗孵育后進行ECL顯色（p-actin做為內參照）。

免疫共沉淀實驗中每組取400卜Lg蛋白裂解液，用2 yg兔IgG進行預處理，加入蛋白A瓊脂糖珠離心后，取上清加入2 μg IP抗體（ZO-1或VE -cadherin，另設無IP抗體IgG對照），室溫于旋轉混勻過夜，加入蛋白A瓊脂糖珠沉淀抗原抗體復合物，離心后用上樣緩沖液處理瓊脂糖珠，煮沸變性，SDS-PACE分離蛋白后按上述方法進行免疫印跡分析（抗occludin或抗p-catenin抗體）。

1.3.6 細胞免疫熒光

40/0多聚甲醛固定經Angl處理12 h后的SCMEC，0.1% Triton-100通透，S%牛血清白蛋白封閉，依次經抗ZO—1或VF -cadherin抗體及FITC標記IgG孵育后，Prolong Gold Antifade封片劑（含DAPI）封片，于Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察結果。

1.3.7統計學分析

本研究中TEER、免疫印跡、放射自顯影等實驗結果均采用GB-STAT軟件（Dynamic Microsys-tems）進行雙因素方差分析及Dunnett's檢驗，P<0.05為差異顯著，P

2結果

2.1 Angl處理增強體外培養SCMEC中Akt激酶活性

體外分離大鼠脊髓微血管內皮細胞（SCMEC），建立體外血一脊髓屏障。由于在培養的內皮細胞系中Angl可通過Akt-PI3K途徑影響內皮細胞活力及血管生成過程[1]，在本研究中我們首先檢測了Angl對SCMEC中Akt活性的影響。分別用Angl、Angl+Wortmannin（ WM，PI3K/Akt途徑抑制劑）處理傳代培養第7d的SCMEC單層，預處理后Oh、4h、8h、12 h收集各組細胞。免疫印跡結果顯示，Angl處理4h后，Aktl磷酸化水平與對照組相比有明顯升高，Wortmannin則可抑制Angl引起的Aktl磷酸化（圖1A、C）；以組蛋白H2B為底物，放射自顯影（圖1B）及液閃計數（圖1D）均顯示Angl處理后，Akt活性有顯著增高。該結果說明，Angl在本研究分離培養的SCMEC中可以活化Akt，且該作用可被Wortmannin所抑制。

2.2 Angl通過影響Akt活性增強體外培養SCMEC屏障功能

為確定Angl-Akt通路對BSCB屏障功能的影響，在Angl處理雙室培養的SCMEC后不同時間點測定跨內皮電阻（ TEER）。結果顯示，Angl處理后4h，SCMEC單層上皮TEER值與對照組相比明顯升高，即Angl可增強體外培養SCMEC屏障功能；此外，該效應可被Wortmannin所拮抗，即與Angl處理組相比，Angl+WM組TEER值有所下降（圖2）。該結果表明，Angl可能通過影響Akt.活性增強體外培養SCMEC屏障功能。

2.3 Angl-Akt通路影響連接蛋白在SCMEC細胞連接處的分布

為進一步明確Angl-Akt途徑影響SCMEC屏障功能的機制，我們檢測了幾種細胞連接蛋白（occluclin、ZO-1、VE -cadherin、β-catenin等）經Angl處理后在細胞連接處的分布變化。為更清晰地觀察細胞接觸面，我們在細胞免疫熒光試驗中采用1：5比例進行傳代培養，在該培養條件下，SCMEC大多（>600/0）呈現多角形。結果表明，緊密連接蛋白ZO-1及粘著連接蛋白VE-cadherin在Angl處理后在細胞連接處的分布顯著增強，而Angl+WM組則無此改變（圖3），提示Angl可通過Akt活性影響連接蛋白在細胞表面的分布，從而增強SCMEC的屏障功能。

2.4 Angl-Akt通路影響SCMEC連接蛋白間的相互作用

在觀察到Angl對ZO一1及VE -cadherin在細胞連接處的分布影響后，我們進一步通過免疫共沉淀檢測了細胞連接蛋白間的相互作用改變。在Angl處理12 h后，收集SCMEC裂解液，統計分析Co -IP結果顯示，Angl可以增強occludin/ZO-1及VE—cadherin/β-catenin之間的相互作用分別達200%及150%以上，而Angl+WM組與Angl處理組相比則抑制了連接蛋白間的相互作用，表明Angl-Akt途徑可通過促進細胞連接復合體的形成提高SCMEC的內皮屏障功能（圖4）。

3討論

脊髓微血管內皮細胞（SCMEC）在構成血脊髓屏障（BSCB）中的功能與腦微血管內皮細胞（BMEC）構成血腦屏障（BBB）中的作用類似，近年來在血中樞神經系統屏障的研究中建立了許多成功模擬BBB或BSCB的體外模型[1416]。本研究通過分離培養成熟SD大鼠脊髓微血管，在適當條件下消化培養SCMEC，經因子Ⅷ特異性抗體檢測，SCMEC純度可達95%[14，15]；在此基礎上，于雙室培養系統中共培養SCMEC和膠質細胞（已知后者可誘導中樞神經系統血腦屏障的形成[17]），通過每日測定TEER反映內皮屏障功能，發現在該培養條件下經6—7 d的培養，TEER值可達45—60Ω·cm2，表明成功建立體外BSCB模型。

Angl基因位于染色體8q22，由498個氨基酸組成，主要由周細胞及血管平滑肌細胞表達，作用于內皮特異性酪氨酸激酶受體Tie-2，其同源蛋白Ang2為其天然的競爭性拮抗劑。轉基因研究證實，Angl基因缺失或Tie-2基因敲除的小鼠胚胎血管形成障礙、通透性增高且缺乏連續性從而不能形成血管網；而Angl過表達的轉基因動物則表現為血管增生變粗且內皮細胞與周細胞的連接完整[18]。Angl在維持血管穩定性方面發揮重要作用，有報道稱其中涉及Akt介導的抗凋亡效應[9，12]；此外，Angl可通過激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）引起柱蛋白（paxillin）磷酸化，加強內皮一基質間的相互作用，增加內皮管狀結構的完整性。在本研究中，我們首先檢測了Angl對體外培養的脊髓微血管內皮細胞Akt激酶活性的影響，即用Angl處理培養SCMEC后收集細胞裂解液，采用[32P]-摻入試驗測定激酶活性，放射自顯影及液閃計數結果均顯示Angl處理后可引起SCMEC中的Akt活性增高。結合以往報道，該結果提示Angl對PI3K/Akt途徑的調節作用在內皮細胞中是普遍存在的。在此基礎上，我們又進一步檢測了Angl對體外BSCB屏障功能的影響，TEER測定結果表明Angl處理4h后，SCMEC屏障功能顯著增強，同時發現該作用可被PI3 K/Akt途徑特異性抑制劑Wortmannin所拮抗，說明Angl可通過影響Akt活性調節BSCB功能，降低其通透性，維持BSCB的穩定。

在內皮屏障結構中，相鄰內皮細胞間的細胞連接的形成及完整性對內皮通透性的維持至關重要。因此，我們檢測了Angl處理后幾種連接蛋白（ occludin、ZO—1、ZO -2、VE -cadherin、β-catenin）的表達情況，免疫印跡結果顯示無明顯改變，說明Angl不是通過影響連接蛋白的表達量調節BSCB的通透性。進一步通過免疫熒光技術發現，Angl處理后支架蛋白ZO-1與鈣黏蛋白VE -cadherin在細胞接觸面的分布明顯增加；此外，緊密連接蛋白occludin與ZO-1，以及VE -cadherin與連環蛋白β-catenin之間的相互作用也在Angl處理后增強，且Angl所引起的效應均可被PI3K-Akt途徑抑制劑Wortmannin所抑制。

綜上結果表明，Angl可通過Akt改變連接蛋白在SCMEC細胞連接處的分布狀態，并影響連接蛋白之間的直接作用，從而改變BSCB的通透性及屏障功能，該結論仍需進一步在體內研究中進行驗證。此外，Angl還可通過其他途徑參與維持血管穩定性及誘導新血管生成，如有研究表明Angl可促進胞漿素和金屬基質蛋白酶一2（MMP-2）的分泌和基底膜的降解，從而促進內皮遷移和管狀結構生成，還可通過降低血小板內皮細胞粘附分子（ PECAM）的磷酸化加強內皮間的連接，維持微血管壁的完整性[19]等等，這些信號轉導分子在Angl調節BSCB屏障功能的過程中是否發揮作用仍需進一步的研究闡明。