高糖干預骨髓來源MAPC細胞周期的研究

羅曼 劉澤灝 李純

摘要：骨髓來源MPAC是具有多向分化潛能的成體干細胞，高糖是干擾MAPC細胞分化趨勢的重要因素。通過流式細胞技術分析高糖對MAPC細胞周期的影響。研究顯示，高糖遲滯MAPC細胞的細胞周期在Cl/S期。進一步研究的結果提示，高糖可以通過TGF-β1調控ERKl/2信號通路，選擇性上調P21蛋白表達，抑制MAPC的細胞周期進程，此時的MAPC細胞Oct4高表達，具有多項分化能力（處于非分化狀態）。

關鍵詞：高糖；MAPC細胞；細胞周期；TGF-βi；P21；ERKl/2

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0229-08

高血糖可以通過阻斷內皮細胞周期的Gl期影響其增殖[1]高糖抑制骨髓內皮祖細胞增殖與其細胞周期在s及G2期被抑制密切相關[2]。細胞周期調控涉及多種周期蛋白參與[3]。細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶（CDK）結合形成二聚體復合物，通過磷酸化作用表達CDK活性，其表達水平可隨細胞周期發生變化；相反，CDK抑制因子通過與CDK結合抑制其活性，例如屬于CIP/KIP家族的P21CIP/WAF-l和P27KIP-l。P21和P27通過抑制周期調控蛋白E-CDK2復合物的形成及其功能表達阻抑細胞周期進程[4]。轉化生長因子TGF-pi可參與調控細胞周期的Gl/S期[7] 。內皮細胞、骨髓間充質細胞等多種細胞均可產生rGF-βl[5，6]。高糖可以促進TGF-β1在血管內皮細胞中表達，并通過TGF-β1介導P21及P27抑制內皮細胞周期調節蛋白E-CDK2復合物形成及其功能表達，阻抑細胞周期進程[8]。轉錄因子Oct4在胚胎干細胞及其他多能干細胞中高表達與維持干細胞的多向分化功能，自我再生和分化能力密切相關[9-11]。在大鼠胚胎干細胞中，Oct4表達水平可隨細胞周期進程發生動態變化，在G2期Oct4達到表達峰值[12，13]。具有多向分化潛能的成體干細胞MAPC在未分化狀態時Oct4高表達，在分化狀態時Oct4表達明顯下調。在不同細胞因子的誘導下MAPC可趨向不同細胞系分化，例如TGF-pi，VEGF等[14-16]。通過高糖干預未分化狀態的MAPC細胞，分析其細胞周期的變化，探討高糖對未分化狀態時MAPC細胞周期影響的機制，從細胞周期層面分析高糖對MAPC增殖和分化的影響；為MAPC細胞在糖尿病血管病變損傷修復中的應用提供理論支持。

1材料和方法

1.1材料

MAPC細胞（俄亥俄州立大學），DMEM培養基購自美國Gibco BRL公司，TGF-pl單克隆抗體購自美國R&D Systems公司，小牛血清購自美國Sigma公司，PD98059抑制劑，P-ERK、P27、P21，CDK2、P-CDK2以及p-actin均購自美國Cell Sig-nal公司，P21抗體購自美國Santa Cruz公司，用于QPCR的引物均由美國Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1 細胞培養

MAPC細胞來源3或4周大小雌性Fischer大鼠[14-16]。在具有良好分化潛能的MAPC中Oct4陽性高表達（作為其特異性的標志之一）。在配制好的非分化細胞培養基中含有5.5 mmol/L右旋葡萄，以及ITS、LA-BSA、PDGF-BB、EGF、LIF等細胞因子以促進細胞更新，同時維持MAPC細胞的未分化狀態。MAPC細胞的高密度培養，將細胞種植在6孔細胞培養板和24孔細胞培養板中，同時加入分化細胞培養基，該培養基的重要成分與非分化細胞培養基相同，但去除了PDGF、EGF和LIF這3種細胞因子。每隔24 h，最多不超過48 h更換一次分化細胞培養基。為排除特異性細胞因子的定向誘導作用，分化培養基中未加入TGF-pl，因此培養基中的TGF-β1均來源于MAPC細胞自身。對MAPC細胞進行干預，分為高糖組（分化培養基中右旋葡萄糖的終濃度為25.5 mmol/L）；正常組（分化培養基中右旋葡萄糖的終濃度為5.5 mmol/L）；對照組（分化培養基中加入左旋葡萄糖，左旋葡萄糖+右旋葡萄糖的終濃度為25.5 mmol/L）。

1.2.2細胞周期分析

利用流式細胞儀檢測MAPC細胞周期的變化。MAPC細胞依照每cm2 200個細胞的密度種植在細胞培養板上，無血清DMEM同步化處理24 h。分別收集24 h、36 h、48 h以及72 h培養時間點的細胞，將其懸浮在4 0C PBS溶液中（含有0.1010葡萄糖），然后迅速加入70%冰乙醇（-20 0C）混勻。混懸細胞液在1 500 g離心力作用下離心，然后用PBS洗滌。用含有50 μL碘化丙啶（PI）和10 μL RNaseMix （20 mg/mL）的PBS重懸浮，使DNA固定，在37 0C中孵育30 min。通過FACS Calibur流式細胞儀分析細胞周期，結果通過Mod-Fit軟件系統分析得到細胞周期圖樣結果。

1.2.3 實時定量PCR分析

利用RNeasy試劑盒（美國QiaGen Sciences公司）從各干預組MAPC細胞中提取總RNA，使用SmartSpec Plus核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，TaqMan逆轉錄試劑盒（美國Applied Biosys-tems公司）將mRNA反轉錄為cDNA，通過Roche美國公司提供的軟件設計Q Real-time PCR引物，并在美國Invitrogen公司合成設計好的引物。Mx3000P熒光定量PCR儀自動分析并輸出Ct值作為結果。通過公式：基因的相對表達量=2-△△Ct（△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=△Ct各樣本或各時間點樣本一△Ct正常樣本或0時段樣本）計算目的基因的相對表達量。各引物序列如下：P21上游5-gacatctcagggccgaaa-3'，下游5'-ggcgcttggagtgatagaaa-3'，P27上游5'-tttga-cttgcat-gaagagaagc -3'，下游5'- agctgtctctgaaagggac-att-3'，Oct4上游5'-ctgtaaccggcgccagaa-3'，下游5' -tg-catggggagagcccaga -3'，GA PDH上、上游：5'-tgggaag -ctggtcatcaac-3，下游5'-gcatcaccccatttgatgtt-3。

1.2.4 Western-blot測定

從各干預組MAPC細胞中提取總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度，并依據測定的濃度在配制的PAGE膠中上樣電泳，電泳后轉膜、封閉，然后依據實驗目的，各PVDF膜分別孵育在5010脫脂牛奶中，其中加入相應的一抗處理，在經過相應二抗處理后用ECL工作液顯色并利用高敏膠片（美國GE公司）在暗室中曝光成像。通過核酸蛋白分析儀掃描分析后，用美國NIH提供的ImageJ軟件分析條帶灰度和面積后，通過內參照p-Actin校正，結果將用于蛋白表達量的半定量分析。

1.2.5 ELISA分析

待測樣品（無論細胞培養上清或是細胞漿）需要加入鹽酸激活，再加入氫氧化鈉中和激活的樣品，然后用TGF-pi ELISA試劑盒（美國R&DSystems公司）處理待測樣品，利用Victor 3V 1 420多標記微孔板檢測儀，在優化的450 nm波長處讀取吸待測樣品的光度值，并依據標準曲線所得公式計算各樣濃度。

1.2.6免疫熒光分析

將實驗用MAPC細胞依據實驗目的種植在chamber板中，在相應的時間點去除細胞培養基并用多聚甲醛溶液固定細胞，加入相對應的一抗處理MAPC細胞，然后加入一抗相對應的熒光標記物標記的二抗，處理好的細胞樣本置于NikonEclipse TE 2000-S熒光顯微鏡下觀察，并用Nikon公司提供的軟件分析處理得到的圖像。

1.2.7統計學處理

所有實驗數據均以s（標準誤）表示，數據分析采用SigmaStat 2.03統計分析軟件（美國Aspiresoftware international公司），統計分析法為t-test或是單因素方差分析；所有的結果均來自3組以上獨立實驗。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖選擇性阻斷MAPC細胞周期在G1/S期

通過流式細胞儀檢測PI標記的MAPC，在非分化培基中培養36 h后，27.80/0處于Gl期，59.90/0處于S期，12.3 010處于G2期。在加入HG的培基中，細胞周期進程發生明顯改變，68.3 010處于Gl期，19.2%處于S期，12.5 010處于G2期（圖1A）。單純高滲培養，MAPC的細胞周期進程未發現明顯變化。在分化培基中高密度培養48 h，MAPC的細胞周期進程未受高糖刺激影響（圖1B），與低糖及高滲培養基中無差異。顯然，高糖刺激主要遲滯處于未分化狀態的MAPC的細胞周期進程（圖1）。

2.2 高糖對MAPC細胞P21和P27表達的影響

CDK-I（細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子）例如P21和P27，通過抑制細胞周期蛋白E-CDK2復合體的形成及其功能調控細胞周期進程。通過Western-blot及Q-PCR檢測高糖培基中MAPC細胞P21、P27、CDK2及P—CDK2（磷酸化CDK2）表達水平。P21 mRNA表達水平是基礎水平的3倍多（n=3，P<0.05）（圖2A）；P21蛋白表達水平上調（圖2C，E）；高滲對P27在mRNA及蛋白水平均無影響（圖2A，B）；P27 mRNA及蛋白表達均未受高糖和高滲影響（圖2A、C）。眾所周知，P21可以參與CDK2復合物的形成，從而使細胞周期停止在Gl期。MPAC總CDK2水平雖未受到細胞培養環境因素影響，但P-CDK2表達明顯被高糖抑制（圖2D）。依據以上試驗結果推測，高糖誘導P21而非P27調控CDK2表達抑制MAPC的細胞周期（圖21。

2.3 高糖作用下MAPC細胞TGF-β1、TGF-βR2、ERKl/2磷酸化水平和P21與細胞周期的關系

在高糖培養基中培養24 h，MAPC細胞TGF-βl mRNA表達水平上調，在36 h時到達表達峰值，為Oh時的20倍以上（圖3 A）。在高糖培養基中培養24 h，MAPC細胞TGF-β1蛋白表達明顯上調，在48 h持續上調（圖3 B）。高滲培養對MAPC細胞TGF-β1 mRNA及蛋白表達無明顯影響。進一步探討TGF-[3R2特異性受體表達水平，結果顯示，在36 h時間點，高糖上調TGF-pR2蛋白表達水平4倍以上（n=3；P<0.05）（圖3C），P-ERKl/2表達也明顯上調（圖3G）；高滲對TGF-3R2蛋白表達無明顯影響（圖3C）。以上結果推測，高糖上調MAPC細胞TGF-β1/TGF-βR2表達調控激活ERKl/2信號通路。進一步探討在高糖刺激下，MAPC細胞TGF -β1與P21蛋白表達及ERKl/2磷酸化之間的關系。通過TGF-β抗體（5mg/L）阻斷培養基中的TGF-β作用，TGF-βR2表達明顯下調（n=3；P<0.05）（圖3C）。同時，上調的P21蛋白在TGF-pl抗體作用下明顯下調（圖3E），ERKl/2磷酸化水平也明顯下調（圖3G）。同時檢測MAPC細胞周期，結果發現高糖刺激對MAPC細胞的周期影響消失，與普通培養條件下的類似（圖1）。為進一步驗證ERKl/2信號通路是否涉及以上的調控變化，特異性MEK1抑制劑PD98059被用于減低ERKl/2磷酸化作用。PD98059阻斷ERKl/2激活（圖3F），同時高糖誘導上調的P21表達水平可以被明顯抑制（圖3D），MAPC細胞周期進程被阻斷（圖1）。以上實驗結果提示，高糖刺激阻抑MAPC細胞周期可以通過TGF-pi激活ERKl/2信號通路上調P21蛋白表達水平調控（圖3）。

2.4 高糖對MAPC細胞AKT的影響

AKT作為一種重要的細胞因子參與細胞周期調控，因此在該實驗中通過Western blot分析了MAPC細胞AKT的激活水平。結果顯示，高糖對MAPC細胞AKT （Ser473）磷酸化水平的影響與低糖及高滲條件下無明顯統計學差異，提示高糖無法通過AKT來調控MAPC細胞周期（圖4）。

2.5 高糖對Oct4表達的影響

既往研究已證明MAPC細胞在高糖培基中培養7d，細胞的增殖及形態發生改變。在高糖和普通培養基中的MAPC細胞Oct4表達水平在mRNA及蛋白水平無明顯變化（圖SA、B）。TGF-pi抗體或PD98059抑制劑對MAPC細胞Oct4表達水平無明顯影響（圖SB）。在分化誘導培基中培養6d后，特異性vWF表達同時，Oct4表達明顯下調（圖5C），與眾多的研究結果相同，提示MAPC開始分化。綜合前期實驗結果推測，高糖對MAPC細胞周期的影響，主要在分化前期，在MAPC保持多向分化潛能狀態時（圖5）。3討論

細胞周期包括間期和有絲分裂期，間期又可分為Gl，S和G2期。Gl期是合成前期，此期主要合成RNA和核糖體，意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備；S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白，DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。G2期即DNA合成后期，在這一時期，DNA合成終止。間期是細胞合成DNA、RNA、蛋白質和各種酶的時期，是為細胞分裂準備物質基礎的主要階段。Gl期的細胞可分為增殖細胞，例如骨髓細胞；休止細胞，可能因外在因素導致該細胞暫時不過渡至S期；不增殖細胞，例如高度分化的神經細胞，這類細胞將停止在Gl期，最后通過分化、衰老至死亡。Gl/S期的過程是重要的細胞周期調控階段，受到多種外在因素的干擾，導致細胞增殖能力發生改變。造血干細胞是明確的周期性細胞，保持連續進入細胞周期循環的能力，始終保持活躍的增殖能力。屬于成體干細胞的MAPC處于分化前期時，需要增殖到一定程度，才能在不同細胞因子的誘導下趨向特定細胞系分化。因此，前期的增殖對后期的分化具有非常重要的意義。高糖阻滯Oct4高表達的MAPC在Gl/S期，可能影響MAPC細胞DNA合成過程，導致其誘導分化趨勢發生改變。研究顯示，P21和P27通過抑制E-CDK2復合體形成及其功能表達干擾細胞周期的Gl/S期[4]。高糖通過TGF-βl介導P21和P27遲滯血管細胞內皮細胞周期的5期[8]。高糖通過上調P21蛋白表達水平遲滯內皮祖細胞的細胞周期[18]。相反，高糖通過下調P21而非P27蛋白表達水平，使處于S期的間質細胞增加，處于Gl期的細胞減少[19]。TGF-β1通過調控P21蛋白表達水平遲滯人結腸癌細胞的細胞周期，而非P27蛋白。綜上所述，高糖可選擇性調控CDK-I（例如P21和P27）來干擾細胞周期。高糖遲滯MAPC細胞周期在Gl/S期，研究顯示與選擇性上調P21表達水平有關，而非P27表達水平，提示P21是阻滯MAPC細胞周期的關鍵因子。

TGF-pi涉及多種細胞的增殖、遷移、定植及分化過程，并且是再生血管形成過程的重要調控因子[20～22]。包括內皮細胞、間充質細胞在內的多種細胞均可通過產生的TGF-β1調控細胞周期[23]。高糖可作為刺激性因素上調多種細胞的TGF-pl表達水平[24，25]。近期研究顯示，高糖可調控大鼠胚胎干細胞TGF-pl表達水平誘導其增殖[26]。TGF-β1通過與細胞膜表面特異性受體的結合發揮功能[27]。實驗中利用TGF-β1特異性抗體中和TGF-β1，可有效抑制高糖調控TGF-βR2表達水平上調，高糖遲滯MPAC細胞周期的作用隨之明顯減弱。研究提示，高糖可調控TGF-βl相關細胞信號通路干擾MAPC細胞的細胞周期。

TGF-pi通過PI3 -KJAKT和MAPK-ERK磷酸化通路遲滯細胞周期在Gl期[28]。研究顯示，高糖可以通過調控大晟胚胎干細胞的PI3 -K/AKT及MAPK信號通路影響細胞周期調控蛋白的表達水平[29]。同時，TGF-β1可參與ERKl/2細胞信號通路調控[30]。實驗結果提示，高糖未能誘導MAPC細胞的AKT及磷酸化AKT表達水平發生明顯改變，PI3 -K/AKT與MAPC細胞周期調控無關。同時，高糖誘導P21表達水平上調，伴隨P-Smad表達上調及CDK2表達下調；提示TGF-pi通過TGF-pR2激活其下游的Smad和非Smad信號通路。實驗組通過PD98059特異性抑制Erkl/2表達，下調的Samd2/3可以恢復，提示ERKl/2可以通過調控Smad通路影響CDK2表達水平。實驗結果推測，高糖通過ERKl/2信號通路調控MAPC細胞的細胞周期。

特異性轉錄因子Oct4在胚胎干細胞及許多具有多向分化潛能的細胞中保持高表達水平，提示細胞保持自我再生能力及多向分化潛能，Oct4是公認的特異性標志[9，10]。在大鼠胚胎干細胞，Oct4表達水平隨細胞周期呈動態變化，在G2期達到表達的峰值[13] 。抗腫瘤藥物諾考達唑可在C2/M期阻斷人胚胎干細胞的周期，伴有Oct4表達下調；去除藥物影響后，細胞周期恢復正常，Oct4表達未隨之恢復[31]。在MAPC細胞中，Oct4表達水平與細胞的再生能力、分化潛能相關。實驗結果顯示，在高糖刺激性下，當細胞周期進程受到到明顯干擾時，Oct4表達水平無明顯改變。說明高糖對MAPC細胞周期的影響是在其未分化階段，MAPC保有多項分化潛能。

有研究顯示，Gl期的長短直接影響祖細胞分化，例如神經前體細胞[32]。高糖干擾MAPC細胞STAT3和TGF-β1間的平衡，導致其分化趨勢的改變網。高糖調控TGF-βl表達水平，通過ERKl/2細胞信號通路影響Smad或非Smad途徑，上調P21表達，抑制CDK2表達，在Gl/S期遲滯Oct4高表達MAPC細胞的周期進程。實驗結果顯示，高糖可以通過調控處于未分化期MAPC細胞（Occ4高表達）的TCF-β1水平，在細胞周期層面改變MAPC細胞的分化趨勢。